本发明专利技术属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定鹿茸的PCR特异引物及其检测方法。使用此方法鉴别鹿茸的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、荧光检测即可完成对样品真伪的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于鹿茸药材、含有鹿茸的制剂以及鹿茸活体材料的快速鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药及中药材鉴定
，特别涉及一种能够特异鉴定鹿茸的PCR 特异引物及其检测方法。主要用于鹿茸药材、含有鹿茸的制剂以及鹿茸活体材料的快速鉴 定。
技术介绍
中药材鹿鸾为鹿科动物梅花鹿Cervusnippon Temminck或马鹿Cervuselaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称"花鹿茸"，后者习称"马鹿茸"，具有壮 肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒之功效。 鹿的种类众多，除了药用的马鹿和梅花鹿之外还有驯鹿、赤鹿等，在药材市场上由 于利益驱使常出现以驯鹿等冒充正品鹿茸的情况，且由于马鹿与梅花鹿的价格存在显著差 异，市场上也常出现两种鹿茸混淆销售的情况。传统鉴别鹿茸的方法包括性状鉴别、显微鉴 另IJ、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。但是传统的检测方法主要依赖于药 材中的化学成分，而化学成分又易受品种及产地的影响。王学勇等使用1对特异性引物建 立了鉴别正品鹿茸（包括梅花鹿和马鹿）和其他近源种鹿茸的位点特异性PCR方法（王学 勇，刘春生，张蓉等，位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究，中国中 药杂志，2009, 23 :3013-3016)，但由于马鹿与梅花鹿的亲缘关系远于其与伪品，因此该方法 对于PCR反应条件和退火温度准确性要求比较苛刻，不适宜大范围推广。陈颖等公开了一 种用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法（授权号：201010555564. 3)，用于梅 花鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法（授权号：201010555571. 3)，所公开的方法 是基于荧光PCR的方法，其成本较高。本专利技术主要结合常规PCR和荧光检测方法，在较短时 间内快速鉴定马鹿和梅花鹿，成本低、适用性好。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或 报道过本专利申请中所提及的PCR引物及方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鹿茸的PCR特异性引物及其检测方法，该方法操作简单、样品 量少、能快速准确的鉴定鹿茸药材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致 DNA含量极少、形态破碎的中药真伪的鉴定。 1. -种鉴定马鹿的特异引物F1、F2,其序列为： Flji-CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA-Si F2:5， -GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3,。 2. -种鉴定梅花鹿的特异引物F3、F4,其序列为： F3 :5' -TCCTAGCAATACACTATACATCTGGC-3， F4:5, -GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3,; 3. -种鹿茸的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： a)从所述材料中提取得到DNA样品； b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95°C预变性5min后， 进行30次循环，循环参数为95°C 30s，55-65°C 45s，后延伸72°C 5min，获得扩增产物； C)用权利要求2所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95°C预变性5min后， 进行30次循环，循环参数为95°C 30s，55-65°C 45s，后延伸72°C 5min，获得扩增产物； d)电泳所述扩增产物，如果存在分子量582bp的单一 DNA条带，则确定所检材料为 马鹿； e)电泳所述扩增产物，如果存在分子量83Ibp的单一 DNA条带，则确定所检材料为 梅花鹿； f)直接在所述扩增产物中加入2 μ L20 X SYBR Green I染料，振荡30s充分混匀， 于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为马鹿 或梅花鹿。 本专利技术采用荧光检测方法检测PCR扩增产物，不需电泳使得检测时间大大缩短， 且仅需简易紫外灯即可完成操作，不需要使用电泳设备和凝胶成像系统。 综上所述，本专利技术提供了快速准确鉴定鹿茸的PCR特异性引物及检测方法，以马 鹿或梅花鹿DNA为模板，能将其从与其亲缘关系极近的其他的鹿类中，高效、准确地鉴定出 来，为鹿茸鉴定提供了一种实用的技术。【附图说明】 图1梅花鹿鉴别引物PCR结果。M :DL2000marker ;P :阳性对照；N阴性对照；1-2 : 梅花鹿；3 :马鹿；4 :驯鹿；5 :白唇鹿；6 :海南坡鹿；7 :水鹿；8 :慶鹿。 图2马鹿鉴别引物PCR结果。M :DL2000marker ;P :阳性对照；N阴性对照；1-2 :马 鹿；3 :梅花鹿；4 :驯鹿；5 :白唇鹿；6 :海南坡鹿。 图3鹿茸PCR产物荧光鉴别结果。1-2 :马鹿；3-4 :梅花鹿。【具体实施方式】 1.高特异性引物的设计 从GenBank查找正品马鹿、梅花鹿及水鹿，驯鹿，白唇鹿等伪品的Cytb 序列。用BioEdit软件进行序列比较，找到差异片段，设计梅花鹿鉴别引物 5，-TCCTAGCAATACACTATACATCTGGC-3，和 5，-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3，；马鹿 鉴别引物 5' -CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA-3,和 5' -GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3, 〇 2.高特异性鉴别PCR方法的建立 2. 1模板DNA提取 取药材（详见表1)约50mg，置2. OmL离心管中，加入磁珠1枚，使用球磨粉碎机粉 碎成粉末。取粉末20mg，分别加入到2mL离心管中；使用柱式骨骼DNA提取试剂盒提取DNA : 加入1000 μ L65°C预热的提取缓冲液，使用漩涡振荡器振荡30s充分混匀；65°C水浴30min ; 加入300 μ L缓冲液及200 μ L氯仿；充分混匀，12000rpm下离心5min ;取500 μ L上清至一 新的I. 5mL离心管，加入500 μ L上柱缓冲液，充分混匀；加入DNA纯化柱中，12000rpm下 离心Imin ;弃穿透液；加入洗脱液500 μ L，12000rpm下离心Imin ;弃穿透液，加入洗脱液 500 μ L，12000rpm下再离心Imin ;弃穿透液，离心DNA纯化柱2min ;加入50 μ L无菌双蒸 水，室温放置2min后12000rpm下离心Imin,取穿透液稀释10倍用于PCR反应。另取鹿鸾 对照药材约50mg，同法制成对照药材模板D NA溶液。 表1样品表 2. 2梅花鹿和马鹿PCR反应体系的建立 取DNA分为两份，分别在200 μ L离心管中进行PCR反应。反应总体积为25 μ L，包 括 10XPCR 缓冲液 2. 5 μ L、dNTP(2. 5mmol · L-l) 1 μ L、TaqDNA 聚合酶（5U · L-1)0. 2 μ L 和 模板1 μ L，其中一份加入梅花鹿上下游鉴别引物（10 μ mol吨-1)各0. 2 μ L，另一份加入马 鹿鉴别引物各〇. 2 μ L，用无菌双蒸水补足反应体积。将离心管置PCR仪，梅花鹿鉴别引物 PCR 反应参数：95°C预变性 5min，循环反应 30 次（95°C 30s，60°C 45s)，72°C延伸 5min，4°C 保温结束反应。马鹿鉴别引物PCR反应参数：95°C预变性5min，循环反应35次（95本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定马鹿的特异引物F1、F2，其序列为： F1：5′‑CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA‑3′ F2：5′‑GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT‑3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，蒋超，李曼，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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