用于检测罕见序列变体的组合物和方法技术

在一些方面，本发明专利技术提供了用于鉴定核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，方法包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，以及将存在于至少两个不同的环状多核苷酸，如两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定为序列变体。在一些方面，本发明专利技术提供了可用于所述方法中的组合物和系统。

【技术实现步骤摘要】
用于检测罕见序列变体的组合物和方法交叉引用本申请要求在2013年12月11日提交的美国临时申请61/914,907、在2014年5月1日提交的美国临时申请61/987,414和在2014年6月11日提交的美国临时申请62/010,975的权益；上述所有美国临时申请均通过引用并入本文。
技术介绍
鉴定复杂群体内的序列变异是一个活跃发展的领域，特别是随着大规模平行核酸测序的出现。然而，由于常用技术的固有误差频率比群体内许多实际序列变异的频率更大，大规模平行测序具有显著的局限性。例如，0.1-1％的误差率已在标准的高通量测序中被报道。当变体频率低，如等于或低于误差率时，对罕见序列变体的检测具有高的假阳性率。检测罕见序列变体的原因有很多。例如，检测罕见特征性序列可用于鉴定和区分有害环境污染物如细菌分类群的存在。表征细菌分类群的常见方式是鉴定高度保守序列如rRNA序列的差异。然而，针对此的典型的基于测序的方法面临与给定样品中如此多数量的不同基因组和成员之间的同源性程度相关的挑战，从而为本已繁琐的程序呈现出复杂的问题。改进的程序将具有加强在多种设置下的污染检测的潜力。例如，用于组装卫星和其他空间飞行器的部件的洁净室可使用本系统和方法进行勘测，以了解存在何种微生物群落，并且开发更好的去污染和清洁技术，从而防止将地球微生物引入其他星球或其样品，或开发用来将由推定的地球外微生物产生的数据与由污染性地球微生物产生的数据进行区分的方法。食品监测应用包括对食品加工厂生产线的定期检测，调查屠宰场，检查餐厅、医院、学校、监狱和其他机构的厨房和食品储存区的食源性病原体。也可以类似地监测水源储备和加工厂。
技术实现思路
鉴于以上所述，对改进的检测罕见序列变体的方法存在需求。本专利技术的组合物和方法满足了该需求，并且还提供了另外的益处。特别是，本专利技术的各个方面提供了对罕见或低频核酸序列变体(有时称为突变)的高度灵敏的检测。这包括对在正常序列背景中可能含有少量变异序列的样品中的低频核酸变异(包括取代、插入和缺失)的鉴定和阐明，以及对在测序错误背景下的低频变异的鉴定。在一个方面，本专利技术提供了一种鉴定序列变体，例如核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，多个多核苷酸中的每个多核苷酸具有5’末端和3’末端，并且该方法包括：(a)将所述多个多核苷酸中的单独多核苷酸进行环化以形成多个环状多核苷酸，其中每个环状多核苷酸在5’末端与3’末端之间具有接点(junction)；(b)扩增(a)的环状多核苷酸；(c)对扩增的多核苷酸进行测序以生成多个测序读取；(d)鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异；和(e)将存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定(calling)为序列变体。在一些实施方案中，该方法包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，以及将存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定为序列变体，其中：(a)该测序读取对应于该至少两个环状多核苷酸的扩增产物；且(b)该至少两个环状多核苷酸中的每一个包含通过连接相应多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接点。所述多个多核苷酸可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，该多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，环化是通过对多个多核苷酸进行连接反应而实现的。在一些实施方案中，单独的环状多核苷酸具有在环化的多核苷酸中独特的接点。在一些实施方案中，该序列变体是单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，该参考序列是通过将序列读取彼此进行比对而形成的共有序列。在一些实施方案中，该参考序列是已知的参考序列，例如参考基因组或其部分。在一些实施方案中，环化包括将衔接子多核苷酸连接到多个多核苷酸中的多核苷酸的5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两者的步骤。在一些实施方案中，扩增通过使用具有链置换活性的聚合酶而实现，例如在滚环扩增(RCA)中。在一些实施方案中，扩增包括将环状多核苷酸置于含有随机引物的扩增反应混合物中。在一些实施方案中，扩增包括将环状多核苷酸置于含有一种或多种引物的扩增反应混合物中，其中每一种引物通过序列互补性与不同靶序列特异性地杂交。在一些实施方案中，基于判定步骤鉴定微生物污染物。可以在进行或不进行富集的情况下对扩增的多核苷酸进行测序，例如通过在测序之前进行富集步骤而在扩增的多核苷酸中富集一种或多种靶多核苷酸。在一些实施方案中，该富集步骤包括使扩增的多核苷酸与多个与基底附接的探针进行杂交。在一些实施方案中，该富集步骤包括在扩增反应混合物中扩增包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B的靶序列，该扩增反应混合物包含：(a)扩增的多核苷酸；(b)包含序列A’的第一引物，其中该第一引物与靶序列的序列A通过序列A与序列A’之间的序列互补性特异性地杂交；(c)包含序列B的第二引物，其中该第二引物与存在于包含靶序列互补体的互补多核苷酸中的序列B’通过B与B’之间的序列互补性特异性地杂交；以及(d)聚合酶，其延伸第一引物和第二引物以产生扩增的多核苷酸；其中靶序列的序列A的5’末端与序列B的3’末端之间的距离为75nt或更短。在一个方面，本专利技术提供了一种鉴定核酸样品中的序列变体的方法，该核酸样品包含少于50ng的多核苷酸，每一个多核苷酸具有5’末端和3’末端。在一些实施方案中，该方法包括：(a)用连接酶环化所述样品中的单独的多核苷酸以形成多个环状多核苷酸；(b)一旦将所述环状多核苷酸与所述连接酶分离，即扩增该环状多核苷酸以形成多联体(concatemer)；(c)对该多联体进行测序以生成多个测序读取；(d)鉴定该多个测序读取与参考序列之间的序列差异；和(e)将从所述少于50ng多核酸的核酸样品获得的所述多个读取中以0.05％或更高的频率发生的序列差异判定为序列变体。该多核苷酸可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，该多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，单独的环状多核苷酸具有在环化的多核苷酸中独特的接点。在一些实施方案中，该序列变体是单核苷酸多态性。在一些实施方案中，该参考序列是通过将测序读取彼此进行比对而形成的共有序列。在一些实施方案中，该参考序列是已知的参考序列，例如参考基因组。在一些实施方案中，扩增通过使用具有链置换活性的聚合酶而实现。在一些实施方案中，扩增包括将环状多核苷酸置于含有随机引物的扩增反应混合物中。在一些实施方案中，扩增包括将环状多核苷酸置于含有一种或多种引物的扩增反应混合物中，其中每一种引物通过序列互补性与不同靶序列特异性地杂交。在一个方面，本专利技术提供了一种在反应混合物中扩增多个不同多联体的方法，该多联体包含靶序列的两个或更多个拷贝，其中该靶序列包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B。在一些实施方案中，该方法包括对反应混合物进行核酸扩增反应，其中该反应混合物包含：(a)多个多联体，其中该多个多联体中单独的多联体包含通过环化具有5’末端和3’末端的单独多核苷酸而形成的不同的接点；(b)包含序列A’的第一引物，其中该第一引物与靶序列的序列A通过序列A与序列A’之间的序列互补性特异性地杂交；(c)包含序列B的第二引物，其中该第二引物与存在于包含靶序列互补体的互补多核苷酸中的序列B’通过序列B与B’之间的序列互补性特异性地杂交；以及(d)聚合酶，其延伸第一引物和第二引物以产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定包含多个多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，所述多个多核苷酸中的每个多核苷酸具有5’末端和3’末端，该方法包括：(a)将所述多个多核苷酸中的单独多核苷酸进行环化形成多个环状多核苷酸，其中每个环状多核苷酸在5’末端与3’末端之间具有接点；(b)扩增(a)的环状多核苷酸；(c)对扩增的多核苷酸进行测序以生成多个测序读取；(d)鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异；以及(e)将存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定为序列变体。

【技术特征摘要】
2013.12.11 US 61/914,907;2014.05.01 US 61/987,414;1.一种鉴定包含多个多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，所述多个多核苷酸中的每个多核苷酸具有5’末端和3’末端，该方法包括：(a)将所述多个多核苷酸中的单独多核苷酸进行环化形成多个环状多核苷酸，其中每个环状多核苷酸在5’末端与3’末端之间具有接点；(b)扩增(a)的环状多核苷酸；(c)对扩增的多核苷酸进行测序以生成多个测序读取；(d)将测序读取与参考序列进行比对以鉴定它们之间的序列差异；以及(e)仅在相对于同一参考序列的序列差异存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸时将所述序列差异判定为序列变体。2.一种鉴定序列变体的方法，该方法包括：将测序读取与参考序列进行比对以鉴定它们之间的序列差异，以及仅在相对于同一参考序列的序列差异存在于至少两个具有不同接点的包含相同靶序列的环状多核苷酸时将所述序列差异判定为序列变体，其中：(a)所述测序读取对应于所述至少两个环状多核苷酸的扩增产物；且(b)所述至少两个环状多核苷酸中的每一个包含通过连接相应多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接点。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多个多核苷酸是单链的。4.如权利要求1或2所述的方法，其中环化是通过将所述多个多核苷酸进行连接反应而实现的。5.如权利要求1或2所述的方法，其中单独的环状多核苷酸具有在环化的多核苷酸中独特的接点。6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述序列变体是单核苷酸多态性。7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述参考序列是通过将测序读取彼此进行比对而形成的共有序列。8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述参考序列是已知的参考序列。9.如权利要求1所述的方法，其中环化包括将衔接子多核苷酸连接到所述多个多核苷酸中的多核苷酸的5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两者的步骤。10.如权利要求1所述的方法，其中扩增通过使用具有链置换活性的聚合酶而实现。11.如权利要求1所述的方法，其中扩增包括将所述环状多核苷酸置于含有随机引物的扩增反应混合物中。12.如权利要求1所述的方法，其中扩增包括将所述环状多核苷酸置于含有一种或多种引物的扩增反应混合物中，其中每一种引物通过序列互补性与不同的靶序列特异性地杂交。13.如权利要求11或12所述的方法，其中不进行富集而对所述扩增的多核苷酸进行测序步骤。14.如权利要求11或12所述的方法，其进一步包括通过在测序前进行富集步骤而在所述扩增的多核苷酸中富集一种或多种靶多核苷酸。15.如权利要求14所述的方法，其中所述富集步骤包括使扩增的多核苷酸与多个与基底附接的探针进行杂交。16.如权利要求14所述的方法，其中所述富集步骤包括在扩增反应混合物中扩增包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B的靶序列，该扩增反应混合物包含：(a)多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体包含通过环化具有5’末端和3’末端的单独多核苷酸而形成的不同的接点；(b)包含序列A’的第一引物，其中该第一引物与靶序列的序列A通过序列A与序列A’之间的序列互补性特异性地杂交；(c)包含序列B的第二引物，其中该第二引物与存在于包含靶序列互补体的互补多核苷酸中的序列B’通过B与B’之间的序列互补性特异性地杂交；和(d)聚合酶，其延伸第一引物和第二引物以产生扩增的多核苷酸；其中靶序列的序列A的5’末端与序列B的3’末端之间的距离为75nt或更短。17.如权利要求1或2所述的方法，其中基于所述判定步骤鉴定微生物污染物。18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸样品包含少于50ng的多核苷酸。19.如权利要求18所述的方法，从所述少于50ng多核苷酸的核酸样品获得的所述多个读取中被判定为序列变体的序列差异以0.05％或更高的频率发生。20.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括在反应混合物中扩增多个包含靶序列的不同环状多核苷酸，其中该靶序列包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B，该方法包括对所述反应混合物进行核酸扩增反应，其中该...

【专利技术属性】
技术研发人员：林盛榕，孙朝辉，赵奇志，邓凌锋，
申请(专利权)人：阿卡拉根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US