一种老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物、试剂盒和其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物，其核苷酸序列为：上游引物Pf：AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG；下游引物Pr：ATTTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC。本发明专利技术还提供相应的试剂盒及其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用。采用本发明专利技术提供的引物及相应的PCR扩增程序和电泳产物检测方法，可对7个国内老芒麦品种（系）进行快速、准确鉴定。也可通过特异扩增条带将上述7个国内老芒麦品种（系）与野生材料和近缘物种进行区分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术辅助育种，特别是涉及一种老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物、试剂盒和其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用。
技术介绍
老芒麦（Elymus sibiricus L.）是禾本科（Poaceae）小麦族（Triticeae）披碱草属（Elymus）的多年生疏丛型中旱生植物，为披碱草属的模式种。老芒麦在北半球温带地区分布较广，是欧亚大陆的广布种，尤其是我国草甸草原和高寒草甸群落的重要组成部分，能形成优势种和建群种。由于其具有抗寒性强、粗蛋白含量高、适口性好、易栽培等优点，老芒麦已成为国家“天保工程” 和“退牧还草工程”中广泛使用的优良牧草之一。传统上对于老芒麦种质的分类和鉴定常依耐株高、穗长、分蘖数等形态学指标，其种植成本高、鉴定周期长；另外形态指标受环境因素影响大，具有不稳定性，在测定过程中也存在较大的人为误差，从而影响鉴定结果的可靠性。生产上推广的老芒麦品种或栽培种多为野生材料驯化而来，形态上与野生材料相似，很难通过传统的形态指标加以准确快速的鉴定，不利于老芒麦品种的知识产权保护、推广和合理利用。随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立和成熟，为发展简便、快速、准确的种质鉴定技术提供了有效手段。SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）标记因具有数量丰富、多态性高、共显性、扩增稳定、引物序列易于交流等优点，已在水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays L.）、棉花（Gossypium herbaceum L）、甜瓜（Cucumis melo L）、西瓜（Citrullus lanatus.）等作物的种质鉴定中应用。 而在草业上SSR分子标记应用不多，仅见于披碱草（Elymus dahuricus）、柱花草（Stylosanthes spp.）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、结缕草（Zopsia japonica）等少数草种。目前，国内尚无老芒麦品种的分子指纹图谱构建及快速检测的研究报道。
技术实现思路
         本专利技术通过一对SSR特异引物（表1）构建了7个老芒麦品种（系）分子指纹图谱；利用此特异引物和检测方法可鉴定7个品种（系），也可将品种和其他不同来源的野生老芒麦材料和近缘物种加以区分，由此提供了老芒麦品种（系）分子指纹图谱、快速检测试剂盒及鉴定方法。本专利技术提供了用于老芒麦品种或品系鉴定的1对特异性SSR引物，具体参见表1。    表1：特异性老芒麦SSR引物本专利技术还提供用于老芒麦品种或品系鉴定的快速检测试剂盒，通过特异性扩增条带能快速准确鉴定老芒麦品种（系），也可准确快速将品种（系）从不同来源的野生老芒麦种质和近缘物种中鉴定出来。本专利技术的试剂盒包括：Golden easy Reaction Mix预混液、Taq酶、特异性SSR引物组P。将上下游引物分别稀释至浓度为10 pmol/μL，依次命名为Pf、Pr液，-20℃保存备用。本专利技术提供老芒麦品种（系）的快速鉴定方法，该方法包括以下步骤：（1）老芒麦种质DNA的提取；（2）PCR扩增：反应条件为：94 ℃ 变性30 sec，65- 61 ℃ 退火30 sec，72℃ 延伸1 min，共5个循环，每个循环退火温度降低1℃；94 ℃ 变性30 sec，60 ℃ 退火30 sec，72 ℃  延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持。（3）对扩增产物进行凝胶电泳并染色；之后对扩增条带进行分析：具有特异性特征条带225bp、170bp和110bp的是同德品种，具有特异性特征条带160bp的是青牧品种，具有特异性特征条带200bp的是新疆老芒麦栽培种，具有特异性特征条带250bp、219bp和149bp的是内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特征条带190bp的是第二种内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特征条带140bp的是川草2号品种，具有特异性特征条带120bp的是红原品系。本专利技术构建了7个老芒麦品种（系）的指纹图谱，参见图2，应用该指纹图谱可以准确快捷的对7个老芒麦品种（系）进行鉴定。本专利技术还提供应用上述指纹图谱从不同来源的野生老芒麦种质和近缘物种中鉴别7个老芒麦品种（系）的方法，步骤如下：（1）提取待测种质DNA的提取；（2）PCR扩增：反应条件为：94 ℃ 变性30 sec，65- 61 ℃ 退火30 sec，72℃ 延伸1 min，共5个循环，每个循环退火温度降低1℃；94 ℃ 变性30 sec，60 ℃ 退火30 sec，72 ℃  延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持；（3）对扩增产物进行凝胶电泳并染色，之后对扩增条带进行分析：若特异性特征条带与指纹图谱中的一个相同，则为7个老芒麦品种（系）中的一个，进而具体判断为哪种老芒麦品种（系）；反之，则不是。本专利技术还对PCR产物凝胶电泳后的检测方法进行了优化，具体如下：所需试剂包括：银染液：将0.8-1 g AgNO3 加入1L蒸馏水中，配成浓度为0.08 %-1 %的银染液，优选地，加0.9 g AgNO3  到 1L 蒸馏水中配成浓度为0.09 %的银染液效果最佳。显影液：配制不同体积显影液所加的各组分的量如表2所示。表2：不同体积显影液配制方法固定液：7%的冰醋酸溶液。银染显影具体操作步骤如下：1）银染：电泳结束后将清洗后的胶放入预先置好的200ml硝酸银染色液中容器中，染色10-15分钟；优选地，室温染色10分钟。2）显影：银染结束后蒸馏水水洗1-2次，再加入预冷的200 ml显影液中显影，至条带清晰可见。    优选地，显影5分钟左右，否则背景色太深。3） 停显：将胶置7 % HAC中停显数分钟；（此步可省）4） 将染色完毕的胶置玻板上，数码相机照相保存。和传统方法相比，该方法时间短、效率高，且能获得清晰电泳图片。本专利技术提供了用于鉴定老芒麦品种（系）特异SSR分子标记引物、指纹图谱构建、快速检测试剂盒及检测方法。采用本专利技术提供的引物及相应的PCR扩增程序和电泳产物检测方法，可对7个国内老芒麦品种（系）进行快速、准确鉴定。也可通过特异扩增条带将上述7个国内老芒麦品种（系）与野生材料和近缘物种进行区分。优异牧草品种的推广利用对于人工草地建制和草地畜牧业发展意义重大。因此，在生产中，确保利用品种的真实性显得尤为重要。采用本专利技术提供的特异引物、品种指纹图谱及快速检测方法，能快速准确地将目前国内推广的7个优良老芒麦品种（系）进行鉴定，并与其他野生老芒麦材料和近缘物种进行区分。该技术方法对于优良品种保护、推广、利用具有重要应用价值。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为7个老芒麦品种（系）应用特异引物P的扩增电泳图谱；图2为国内7个老本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物Pf：AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG；下游引物Pr：ATTTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC。

【技术特征摘要】
1.一种用于老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物Pf：AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG；
下游引物Pr：ATTTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC。
2.一种用于老芒麦品种或品系鉴定的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。
3.权利要求1所述的特异性引物、权利要求2所述的试剂盒在老芒麦品种或品系快速鉴定中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体步骤如下： （1）提取老芒麦种质DNA并应用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；
（2）对扩增产物进行凝胶电泳并染色，对扩增条带进行分析：具有特异性特征条带225bp、170bp和110bp的是同德品种，具有特异性特征条带160bp的是青牧品种，具有特异性特征条带200bp的是新疆老芒麦栽培种，具有特异性特征条带250bp、219bp和149bp的是内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特征条带190bp的是第二种内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特征条带140bp的是川草2号品种，具有特异性特征条带120bp的是红原品系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：94 ℃ 变性30 sec，65- 61 ℃ 退火30 sec，72℃ 延伸1 min，共5个循环，每个循环退火温度降低1℃；94 ℃ 变性30 sec，60 ℃ 退火30 sec，72 ℃  延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持。
6.根据权利要求4所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢文刚，张俊超，王彦荣，赵旭红，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62