本发明专利技术涉及基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。本发明专利技术人经过比较筛选，找到了针对RSV特异性良好的环介导等温扩增引物，所述引物针对含有RSV以外的核酸不发生特异性扩增。本发明专利技术的方法可良好地应用于鉴定RSV成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学和核酸检测
。具体地，本专利技术涉及基于环介导的 等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。
技术介绍
呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV)于1955年首次从黑猩猩 中分离出毒株。并于1955年从婴儿中分离得到与黑猩猩中株有相同抗原特性的病毒株，在 随后的研究中发现，该病毒以人为自然宿主，是引起人呼吸道感染的重要病原。该病毒在 体外感染细胞时会使相邻的细胞形成合胞体，产生块状的细胞病变，并因而得名。RSV是不 分节段的负股单链RNA病毒，属副粘病毒科，肺病毒亚科，肺病毒属；与副流感病毒，麻疫病 毒，偏肺病毒属同一科。 RSV感染人会引起上呼吸道感染，出现咳嗽，流涕，低烧等症状，下呼吸道感染在轻 度感染的婴儿中也很普遍，长时间的RSV感染会引起细支气管炎，哮喘及由肺炎引起的缺 氧，严重的可危及生命。RSV感染在婴儿和成人中都有发生，但婴儿，老人和有心肺疾病及免 疫缺陷的人更容易被感染，而且会表现出更严重的症状。大约2/3的婴儿会在出生后的第 一年之内经历RSV感染，大约90%的婴儿会在第二年经历RSV感染，几乎所有的婴儿都会在 出生两年内经历至少一次RSV感染，其中有一半会经历两次RSV感染。在小于5岁的儿童 中，20%的住院治疗，18%的急诊以及门诊是由RSV感染引起的。儿童在最初几年会经常性 的经历RSV的重复感染，即使在成年后，RSV依然可以感染同一个体。RSV的重复感染不依 赖于抗原的改变。RSV在初次感染时会引起下呼吸道感染，但在再次感染时症状会减轻，成 人经历RSV感染时基本没有症状。6周到六个月的婴儿最易发生严重的RSV感染，其高峰出 现在2到3月大小。 RSV的发病率随季节而变化，在温带地区一般在每年的冬季和初春爆发，一二月份 为发病的高峰，在热带地区爆发于雨季。RSV依据抗体反应分为A，B两个亚型，A型和B型 交替流行传播，A性为主要流行亚型并具有更强的致病性。A型和B型的交替流行为RSV频 繁的重复感染提供了一种可能的机制，即通过亚型交替可以规避由前一种流行亚型带来的 宿主免疫机制。但同一亚型的重复感染也频繁出现。 现有技术中，呼吸道合胞病毒的检测方法主要包括病毒培养分离，酶连免疫检测， 荧光抗体检测，胶体金快速检测，多重PCR检测，荧光定量PCR检测，NASBA检测（Nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖的扩增反应），基因芯片检测的检测 技术。 病毒培养技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病 毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测金色标准， 但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，灵敏度不足。而且操作程序复杂，对实验场 地和设备有生物安全等级要求，检测过程长（至少要一周以上），不能用于现场检测，对不 同病毒的检测结果不同。 基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗 体之间的特异结合，通过偶联了显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不 依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过 程，灵敏性要比分子检测低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较 长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原漂变产生的新的病毒亚型的检测 能力也值得怀疑。 病原的核酸分子检测通过聚合酶对病原的核酸分子进行扩增，然后利用荧光，电 泳等方法对反应过程或产物进监测，根据反应是否进行或产物是否出现来判定病原是否出 现。与普通PCR相比多重定量PCR，可以实现多种病毒的同时检测，而且反应过程可以实时 监测，还可以确定样品中病原的量，灵敏度也高于普通PCR。但基于PCR的方法都需要热循 环仪等设备，对检测场地也有要求，定量PCR还需要专门训练，这些都限制了 PCR相关技术 在快速检测中的应用。 基因芯片等基于杂交的检测方法利用病毒特异的探针或探针组通过孵育，杂交， 显色，结果扫描等步骤实现多种病毒的高通量检测，但生产芯片需要昂贵的设备，杂交过程 耗时很久，结果检测也需要特殊仪器及专业人员。这些都限制了该种技术在快速检测中的 应用，使其只能作为一种研究手段实现对病原基因信息的分析。 NASBA也是一种恒温，连续的酶介导的核酸扩增技术，该技术同时使用T7RNA聚合 酶，反转录酶，与核糖核酸酶同过转录与反转录过程的交替进行实现模板的扩增，但该技术 需要通过分子信标等荧光探针实现结果的检测，因而需要特殊设备，且主要用于RNA模板 的检测。由于结果检测需要专门的设备，该技术主要用实验室检测，很难用于现场检测。除 了 NASBA外还有SDA，HAD，RCA等恒温扩增技术可能用于病原检测。 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，环介导的等温扩增）是于 2000 年首次报道并在其后经过不断改进形成的一种等温，连续，快速，高特异和可视化检测的核 酸扩增方法。鉴于难以找到合适的、较广谱的扩增引物，以及，难以实现根据颜色变化进行 结果判定，目前国内外还没有RSV的RT-LAMP检测产品出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测方法以 及试剂盒。 在本专利技术的第一方面，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括： 呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位（即以N基因起始密码子ATG 中A作为第1位起算）所示的多核苷酸； 呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位（即以L基因起始密码子 ATG中A作为第1位起算）所示的多核苷酸。 在一个优选例中，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示 的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所不； 所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核 苷酸序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。 在本专利技术的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备鉴定呼吸道合胞病 毒的检测试剂或试剂盒。 在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括：以待 测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中 包含呼吸道合胞病毒； 其中，所述的特异性扩增引物包括： 引物对 I :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物对 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ; 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物对 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物对 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和 引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。 在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括：呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610‑930位所示的多核苷酸；呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452‑3052位所示的多核苷酸。
【技术特征摘要】
1. 分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括： 呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示的多核苷酸； 呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸。2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编 码区第610-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所示； 所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸 序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。3. 权利要求1或2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备鉴定呼吸道合胞病毒 的检测试剂或试剂盒。4. 一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，所述方法包括： 以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待 测样品中包含呼吸道合胞病毒； 其中，所述的特异性扩增引物包括： 引物对 1 :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物对 2 :SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; 引物对 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物对 4 :SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物对 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和 引物对 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的扩增是环介导等温扩增。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增条件是： (1) 60±2°C恒温反应 60±10min ;或 (2) @60±2°〇30秒，@601：±21：30秒采集荧光；步骤@-@重复进行60±10次。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物 对1-6混合物，环介导等温扩增反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝柯，穆永林，陈倩倩，张驰宇，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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