一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方法技术

本发明专利技术公开了一种引物、靶核苷酸扩增方法及检测靶核苷酸序列扩增的方法，属于生物技术领域。所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括B片段，所述反向引物的5'末端包括A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，A片段与A1片段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。所述靶核苷酸扩增方法，提供靶核苷酸，加入正向引物和反向引物，所述正向链和所述反向链分别扩增。所述检测靶核苷酸序列扩增的方法用于检测靶核苷酸是否扩增。所述引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，所述靶核苷酸扩增方法与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法。
技术介绍
核苷酸是组成核酸的基本单位，对核苷酸遗传序列分析方法是一种鉴定遗传疾病、病原微生物等非常强有力的方法，该核苷酸序列分析方法可直接分析生命体的遗传特征，并且，该核苷酸序列分析方法检测的对象是基因自身。常用的体外扩增核苷酸序列的方法包括PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)技术，该PCR技术由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步组成一个周期，该周期循环进行，使得目的核苷酸得以扩增。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题：现有的PCR技术的扩增效率仍不能满足人们的要求，因此，该PCR技术的扩增效率有待提高。
技术实现思路
为了解决现有技术中PCR技术的扩增效率低的问题，本专利技术实施例提供了一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方法。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种引物，所述引物适用于扩增的所述靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括所述C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。另一方面，本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法，所述方法包括：提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段；加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反向引物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增；所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQIDNO.6所示；所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反向引物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别通过所述A片段和所述A1片段互补形成环链，所述第一正向链的5'末端和3'末端互补成环，所述第一反向链的5'末端和3'末端互补成环；当所述反向引物的5'末端包括A1片段时，所述第一正向链的两端均具有所述A片段，所述第一反向链的两端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互补配对，使所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的5'末端和3'末端均互补形成环链；所述第一正向链和所述第一反向链在互补后，在聚合酶的催化下，所述第一正向链和所述第一反向链作为模板进行延长扩增，得到第二反向链和第二正向链；将所述第二反向链和第二正向链解链，解链后的所述第二反向链和第二正向链作为下一个延长扩增反应的模板进行扩增，分别得到所述第二反向链和所述第二正向链的互补链，并循环进行，使得所述靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成所述靶核苷酸的扩增。具体地，当所述靶核苷酸为RNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。具体地，当所述靶核苷酸为DNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。具体地，所述恒温的温度为60-65℃。具体地，所述等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，所述解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。具体地，在所述正向引物和所述反向引物中，所述A片段的长度小于所述B片段和所述C片段的长度。又一方面，本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的检测上述靶核苷酸序列扩增的方法，在所述等温扩增反应液中添加检测试剂，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的靶核苷酸，若电泳结果得到清晰明亮的特征性条带，则靶核苷酸已扩增；若未出现特征性条带，则靶核苷酸未扩增。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术提供的引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸，该引物与靶核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增。同时，本专利技术提供的靶核苷酸扩增方法，其扩增过程在变性反应过程中无需的温度变化，且全程的反应条件均在恒温条件下进行，进而避免了温度变化，提高了扩增的效率，在序列互补链成环后，高效率的加长重复片段，利用该新型引物与核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增，能够用于检测各种基因或基因突变的方法，与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。同时，本专利技术提供的检测方法能够快速有效的检测出靶核苷酸是否扩增。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例二提供的正向引物和反向引物的序列示意图；图2是本专利技术实施例二提供的正向链和反向引物互补以及反向链和正向引物互补配对的示意图；图3是本专利技术实施例二提供的第三反向链和第三正向链的示意图；图4是本专利技术实施例二提供的第三正向链和反向引物以及第三反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；图5是本专利技术实施例二提供的第四正向链和第四反向链的示意图；图6是本专利技术实施例二提供的第四正向链和反向引物以及第四反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；图7是本专利技术实施例二提供的第一正向链和第一反向链的示意图；图8是本专利技术实施例二提供的第一正向链和第一反向链分别通过正向引物和反向引物扩增，以及互补成环的示意图；图9是本专利技术实施例二提供的第二反向链和第二正向链的示意图；图10是本专利技术实施例二提供的解链后的第二反向链和第二正向链作为模板进行扩增的示意图；图11是本专利技术实施例二提供的得到第二反向链和第二正向链的互补链的示意图；图12是本专利技术实施例二提供的反应液A的电泳图；图13是本专利技术实施例二提供的反应液B较高浓度样本的电泳图，且泳道1为HAVDNA(1×10-15mol)，泳道2为HCVDNA(1×10-15mol)，泳道3为HBVDNA(-)，泳道4为DL2000的Marker，泳道5为HBVDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物，其特征在于，所述引物适用于扩增靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补。

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，所述引物适用于扩增靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。2.一种非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段；加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反向引物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增；所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQIDNO.6所示；所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反向引物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘映乐，罗虹，唐景峰，
申请(专利权)人：武汉海帝客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42