本发明专利技术公开了一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。本发明专利技术提供的引物组合物，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ包括序列表的序列1所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅱ包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅲ包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅳ包括序列表的序列4所示的核苷酸序列。本发明专利技术的专用引物适用于对森林脑炎病毒进行特异性检测和定量分析。本发明专利技术的优点：（1）只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；（2）特异性高；（3）快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成；（4）灵敏度高；（5）鉴定方便简单。本发明专利技术特别适用于临床标本的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。本专利技术提供的引物组合物，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ包括序列表的序列1所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅱ包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅲ包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅳ包括序列表的序列4所示的核苷酸序列。本专利技术的专用引物适用于对森林脑炎病毒进行特异性检测和定量分析。本专利技术的优点：（1）只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；（2）特异性高；（3）快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成；（4）灵敏度高；（5）鉴定方便简单。本专利技术特别适用于临床标本的快速检测。【专利说明】用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用
本专利技术涉及一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。
技术介绍
森林脑炎（Forest encephalitis)又名蝶传脑炎（Tick-borne encephalitis, TBE)是由森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV)所致的一 种的以侵袭中枢神经统为主的自然疫源性急性传染病。1936年，Tkachev首次从患者分离 到该病毒。1937年，证实蜱为该病毒的传播媒介。我国于1942年首次发现该病，1952年从 患者及蜱中分别分离到森林脑炎病毒。近些年来我国森林脑炎有上升趋势，并呈现了新的 流行特性。 森林脑炎传统临床诊断主要依赖于患者血清中特异IgM抗体的检测，以及利用普 通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核酸。这些方法需时长且需要特定的仪器， 难以满足临床快速诊断的需要。 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)法具有在 等温条件下即可高速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用4条特异引物（F3、 FIP、B3和BIP)在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断复制扩增核酸。在反应体系中可 添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增 的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。 本专利技术提供的第一组引物组合物（引物组合物甲），包括DNA片段-I、DNA片 段_ II、DNA片段-III和DNA片段-IV ;所述DNA片段-I、所述DNA片段-II、所述DNA片 段-III和所述DNA片段-IV均为单链DNA片段；所述DNA片段-I包括序列表的序列1所 示的核苷酸序列，所述DNA片段-II包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片 段-III包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段-IV包括序列表的序列4所 示的核苷酸序列。 所述引物组合物甲还可包括DNA片段-V和/或DNA片段-VI ;所述DNA片段-V 和所述DNA片段-VI均为单链DNA片段；所述DNA片段-V包括序列表的序列5所示的核 苷酸序列，所述DNA片段-VI包括序列表的序列6所示的核苷酸序列。 所述引物组合物甲具体可由所述DNA片段-I、所述DNA片段-II、所述DNA片 段 _ III、所述DNA片段-IV、DNA片段-V和DNA片段-VI组成。 所述DNA片段-I具体可如序列表的序列1所示，所述DNA片段-II具体可如序 列表的序列2所示，所述DNA片段-III具体可如序列表的序列3所示，所述DNA片段-IV具 体可如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V具体可如序列表的序列5所示，所述DNA片 段-VI具体可如序列表的序列6所示。 本专利技术提供的第二种引物组合物（引物组合物乙)，包括DNA片段-W、DNA片 段-VILDNA片段-IX和DNA片段-X ;所述DNA片段-W、所述DNA片段-W、所述DNA片 段-IX和所述DNA片段-X均为单链DNA片段；所述DNA片段-W包括序列表的序列1所 示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-W包括序列表的序列2所示的核苷酸序 列的反向互补序列，所述DNA片段-IX包括序列表的序列3所示的核苷酸序列的反向互补 序列，所述DNA片段-X包括序列表的序列4所示的核苷酸序列的反向互补序列。 所述引物组合物乙还可包括DNA片段-XI和/或DNA片段-ΧΠ ;所述DNA片段-XI 和所述DNA片段-ΧΠ 均为单链DNA片段；所述DNA片段-XI包括序列表的序列5所示的核 苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-ΧΠ 包括序列表的序列6所示的核苷酸序列的反 向互补序列。 所述引物组合物乙具体可由所述DNA片段-W、所述DNA片段-W、所述DNA片 段-IX、所述DNA片段-X、所述DNA片段-XI和所述DNA片段-ΧΠ 组成。 所述DNA片段-W具体可如序列表的序列1的反向互补序列所示，所述DNA片 段-W具体可如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-IX具体可如序列表的 序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-X具体可如序列表的序列4的反向互补序列 所示，所述DNA片段-XI具体可如序列表的序列5的反向互补序列所示，所述DNA片段-ΧΠ 具体可如序列表的序列6的反向互补序列所示。 本专利技术还保护以上任一所述引物组合物在辅助鉴定森林脑炎病毒中的应用。 本专利技术还保护一种辅助鉴定森林脑炎病毒的方法，包括如下步骤： (1)提取待测病毒的RNA ; (2)以步骤（1)得到的RNA为模板，用以上任一所述的引物组合物进行反转录环介 导等温扩增； (3)通过检测步骤（2) De扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为森林脑炎病毒。 所述反转录环介导等温扩增的反应条件可为：60?65°C反应30?60min,然 后75°C 2min终止反应。所述反转录环介导等温扩增的反应条件具体可为：63°C反应 35-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应体系中，F3和B3的浓度均 为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LB和LF的浓度均为20pmol/L。 RNA提取可采用常规方法，如使用Qiagen RNeasy Mini kit或其他同类试剂盒。 可在反转录环介导等温扩增的过程中通过实时浊度仪进行结果判断，如果观察到 典型的扩增曲线，待测样本为候选的森林脑炎病毒，如果没有观察到典型的扩增曲线，待测 样本为候选的非森林脑炎病毒。判断原理如下：核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷 酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg 2+ (或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉 淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸 大量合成，从而判断模板是否为靶序列，因此可以采用实时浊度仪及其配套程序软件实时 检测反应液的浊度变化。 可通过荧光染料的颜色变化进行结果判断。应用本方法进行判定时，LAMP体系 中需要有钙黄绿素、Mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
引物组合物，包括DNA片段‑Ⅰ、DNA片段‑Ⅱ、DNA片段‑Ⅲ和DNA片段‑Ⅳ；所述DNA片段‑Ⅰ、所述DNA片段‑Ⅱ、所述DNA片段‑Ⅲ和所述DNA片段‑Ⅳ均为单链DNA片段；所述DNA片段‑Ⅰ包括序列表的序列1所示的核苷酸序列，所述DNA片段‑Ⅱ包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片段‑Ⅲ包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段‑Ⅳ包括序列表的序列4所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦成峰，姜涛，刘娟，李晓峰，邓永强，秦鄂德，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。