Vero细胞森林脑炎灭活疫苗制造技术

一种Ｖｅｒｏ细胞灭活森林脑炎疫苗，其特征在于该疫苗包含有效量的在Ｖｅｒｏ细胞上增殖的灭活森林脑炎病毒和疫苗佐剂，该灭活森林脑炎病毒来自森“张”病毒株，优选森“张”病毒株Ｐ↓［９－３］。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种Vero细胞森林脑炎灭活疫苗及其制备方法，特别是工业化制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的方法及由此方法制备的疫苗。
技术介绍
森林脑炎是由森林脑炎病毒引起的，以蜱类为主要传染源，以侵犯中枢神经系统为主的自然疫源性急性传染病，病死率在20-30％，是一种严重危害人民健康的病毒性传染病。用于预防森林脑炎的疫苗。先后经历了用鼠脑、鸡胚、地鼠肾等基质制备森林脑炎灭活疫苗，目前我国使用的是地鼠肾细胞森林脑炎灭活疫苗；国外使用的是鸡胚细胞森林脑炎灭活疫苗；重组基因工程疫苗正处于研究之中，但至今尚无重大突破。中国当前生产使用的地鼠肾森林脑炎灭活疫苗，对于降低森林脑炎的发病率确实起到了重要的作用，使森林脑炎的发病率得以下降，但是其免疫效果并不理想，二针免疫后人体的抗体阳转率33％左右，加强免疫一针后人体的抗体阳转率50％左右，且30％发病者有疫苗接种史，加之接种后有严重的副反应，可见现用疫苗的应用效果并非理想。现用技术中生产森林脑炎疫苗存在的主要问题是，疫苗生产中因使用动物原代细胞培养，所使用动物的饲养、繁殖、无菌条件的控制及解剖均存在诸多不便，从而限制了生产规模，且无法保证这些来自普通动物级的细胞基质不携带外源因子，更不适合大规模工业化生产。因此，急需一种更安全、更有效的森林脑炎疫苗用于人们预防接种。使用一种既对森林脑炎病毒敏感又可用于旋转培养的传代细胞基质是解决问题的重要途径之一。Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiopsmonkey)肾建立的猴肾细胞系。其93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCCNO.CCL-81。经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，已被WHO证明可作为疫苗生产的基质(WHO Tech.Rep.Ser.，1987，1)。Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国培养研制出来并获批准生产，并且有关应用Vero细胞制备疫苗的研究时有报道，但关于应用Vero细胞制备森林脑炎疫苗的研究还未见报道。我们通过试验证明Vero细胞也是森林脑炎病毒的敏感细胞，用其制备森林脑炎疫苗，一方面可避免动物原代细胞培养可能带来的外源因子的污染，可事先控制细胞的质量；另一方面可通过利用病毒在细胞系中繁殖和增殖来实现高度工业化的方法，大量生产疫苗，简化工艺。这不仅由于可避免必须处理相当大数量的动物，而且用于感染的细胞基质容易控制在均一的水平，可控制并获得满意的产率。综上所述，本专利技术克服现有技术的缺点，提供了Vero细胞森林脑炎灭活疫苗及其生产的方法，该方法可在安全、迅速和经济的条件下应用于大规模生产，并且可获得高纯度、理想工业产率的有效疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的方法，该方法的核心是利用Vero细胞工业化大规模生产森林脑炎灭活疫苗。本专利技术的另一目的在于提供一种安全有效的人Vero细胞森林脑炎灭活疫苗。通过细胞系的Vero细胞培养而获得的疫苗，包含森林脑炎病毒，并且细胞DNA含量小于100pg/剂。该疫苗既具有功效又具有对可能与病毒接触的任何人进行全身性给药时所必需的安全性。本专利技术的其他目的，在下面对本专利技术的具体描述中体现出来。附图说明附图1是本专利技术优选的制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的工业化生产流程示意图。本申请人经过长期研究发现，Vero细胞也是森林脑炎病毒的敏感细胞，适合于森林脑炎病毒灭活疫苗的生产，特别是选择森“张”病毒株作为森林脑炎病毒，采用Vero细胞生产森林脑炎病毒灭活疫苗。Vero细胞最早来源于ATCC，本专利技术采用的Vero细胞来源于中国药品生物制品检定所，代次为126代。将126代Vero细胞经过传代扩增后液氮冻存，作为细胞主代种子库；由细胞主代种子库细胞传代扩增后，液氮冻存作为生产细胞工作种子库(MWCB)；由生产细胞工作种子库细胞制备生产用细胞。细胞传至170代，进行细胞致肿瘤原性试验Vero细胞致肿瘤原性试验阴性，证实Vero细胞安全可靠、未发生致瘤性变异；细胞传代稳定性试验细胞形态特征观察用显微镜观察，发现细胞贴壁及生长良好，与生产细胞工作种子库细胞无变异，证实细胞传代是稳定的；细胞外源因子检查试验传代细胞的无菌试验、支原体检查及外源因子检查均为阴性；核型的染色体数目分布高峰(56-58条)分析表明，与美国ATCC报告的(47-60条)基本一致。按鉴定代次前推10代即160代，作为疫苗生产用细胞最高代次，在此限定代次内，可提供大批量的培养基质，满足生产需要，并能保证其用于疫苗生产是安全可行的。结果见表1。根据本专利技术，一种Vero细胞森林脑炎灭活疫苗，其特征在于该疫苗包含有效量的在Vero细胞上增殖的灭活森林脑炎病毒及其疫苗佐剂，其中该灭活森林脑炎病毒优选来自森“张”病毒株P9-3。森“张”株病毒在病毒学属于黄病毒属黄病毒科(Flaviviridae-Flavivirus)。该病毒株的鼠脑株，森“张”株P9-3，由本申请人保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC V202004，保藏日期为2002年9月9日。该Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的疫苗病毒株的病毒感染滴度，可达到并稳定在8.001gLD50/ml，经全面检定，证明病毒生物学活性稳定，抗原性广谱和免疫原性良好，无污染外源因子。检定结果见表2。本专利技术的Vero细胞森林脑炎灭活疫苗，还含有常用病毒稳定剂，优选为人血清白蛋白。根据本专利技术，该佐剂为常用疫苗佐剂，如Al(OH)3等等。根据本专利技术，一种Vero细胞森林脑炎病毒灭活疫苗的制备方法，包括通过Vero细胞用森林脑炎病毒株制备病毒液，以及用诸如佐剂、稳定剂等把纯化的病毒液配制成疫苗。(1)细胞培养细胞培养采用Vero细胞。Vero细胞可在适宜的细胞培养瓶中静止或旋转瓶旋转进行培养。Vero细胞的培养，可使用适宜的动物细胞培养液，PH为7.0-8.0，培养温度36-38℃，细胞的接种浓度为1.0×104-106/ml。待细胞长成单层时接种病毒。根据本专利技术，所用的适宜动物细胞培养液，可以是常用的细胞培养液，例如，4-10％(优选6-8％)的小牛血清的MEM液或199液等等。PH为7.0-8.0，培养温度36-38℃。(2)病毒接种在Vero细胞长成单层时接种森林脑炎病毒，如森“张”病毒株。病毒的感染剂量(M.O.I)为0.01-1.0，优选为0.01-0.05，更优选为0.01。(3)病毒液收获病毒在感染细胞中繁殖和增殖，产生病毒悬液形式的病毒液，将森林脑炎疫苗株病毒接种到上述的细胞基质中，收获培养3-5天后的细胞培养病毒液。收获病毒液后，可添加新鲜的培养液继续培养，待病毒增殖后再次收获病毒液；可连续多次添加培养液和收获病毒液。多次收获病毒液可为1-9次。(4)病毒灭活病毒液用化学试剂，如福尔马林，灭活病毒。如果是多次收获病毒液，可合并各次的病毒液，然后用化学试剂灭活病毒。灭活前后均需取样进行无菌试验，测定病毒滴度以及灭活后需进行病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宗明，韩亮，赵红丽，洪成龙，岳立广，刘双军，赵丽红，钱依群，惠连，王晓宏，赵建，郝富勇，王伟，
申请(专利权)人：长春生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：