通过序贯多元酸沉淀进行的血浆蛋白分级分离制造技术

存在对于自全血中分离血浆的新型更简化方法的公认需求，以及对于分离含不同血浆蛋白的无细胞血浆级分的需求。本发明专利技术透露了用于使用水相体系(经由添加相对低浓度的单个聚合物在血液或含血液的溶液中形成)实现自血细胞中分离(澄清)血浆蛋白的方法。本发明专利技术亦透露了替代广泛使用的科恩型血浆蛋白分级分离法的使用多元酸的简单序贯添加的方法，科恩型血浆蛋白分级分离法基于序贯添加高达40%(v/v)乙醇及其它沉淀剂。使用多元酸的简单序贯添加的方法得到与科恩分级分离法获得的分离相似的血浆蛋白级分(即纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白)的依次分离，因此可适用于减少现行血浆蛋白纯化过程中的溶剂使用和溶剂相关的过程复杂情况。其亦可支持基于聚合物膜的容器在新型无溶剂血浆分级分离方法中的用途。所公开的方法亦可适用于研究和诊断应用中较小规模的血浆蛋白分离。所述一般方法为稳健的并且可在广泛范围的工艺变量(例如温度和pH)内起作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术的
本专利技术涉及血液组分的分离。具体而言其涉及用于将血浆分级分离成药学上有用的组分的方法。专利技术背景用于大分子分离和纯化的非色谱法来自天然来源的血浆蛋白的生产者长期依赖于基于乙醇的差异蛋白质沉淀以在经由柱色谱法纯化各蛋白质之前序贯地分离蛋白质级分。这类方法尤其适于以密集型生产经济运行的较大规模分离。然而，它们为技术上复杂的并且需要高度培训的技术人员以及昂贵的设备和设施。涉及生物技术分离过程的科学家正在处理甚至更大型的过程以及对于降低生产产品的成本的需要。他们重新检验诸如双水相体系中的沉淀和分配等技术的用途(1, 2, 3)。分配的主要优点为其基于两个液(L)相的形成，由此可在L-L相界面收集细胞和细胞碎片，所述细胞和细胞碎片通过界面张力维持在所述界面。因此，如果靶蛋白可以选择性方式显著程度地分配到一相中，则可能全在一步中实现某种程度的靶标澄清(细胞碎片去除)、纯化和浓缩(上述参考文献)。分配的主要缺点为含水聚合物两相体系的形成通常需要向含有靶标的溶液中加入诸如葡聚糖和聚乙二醇[PGE]等两种聚合物或者加入一种聚合物和一种高浓度盐(例如PEG和0.5 M磷酸盐)。所述双聚合物体系可以是昂贵的而聚合物-盐体系具有低容量(溶解性)——对于抗体蛋白而言常常为1-2 g/L (3)。最近公开了通过加入相对低浓度的单种生物相容性向温聚合物来澄清生物技术原料的方法(4)，其允许经由基本上无聚合物相的形成来澄清，所述相包含大部分蛋白质，并且通常漂浮于密度更大的富含聚合物的下相之上。亦可经由添加沉淀剂来改良上相以实现靶标的进一步浓缩和纯化。单聚合物双水相体系早已知道蛋白质可在含水聚合物两相体系的相之间选择性分配，所述体系使用两种聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)或一种聚合物(例如PEG)和相对高浓度的水构造盐(water structuring salt)(例如磷酸钠)自发形成。后一种体系更不昂贵但是它们趋于具有更低的蛋白质溶解性并因此具有更低的容量(3,4)。亦早已理解的是，细胞和细胞碎片，以及其它微米级胶体，趋于蓄积在两相的界面，它们通过界面张力维持在所述界面。上述两种类型的LL体系的一个变型为聚合物-聚合物体系，其中一种聚合物为热响应性聚合物，其在升高的温度和其它条件下自缔合(3,4)。先前将此行为用于在相分离和两相离析之后从一相的聚合物中分离蛋白质，并回收相聚合物以再使用。除所述两种类型的相体系之外，还已认可第三种类型——单聚合物体系。这些体系在这样的条件下形成，其中加入的亲水聚合物自缔合并因此形成较轻的贫聚合物相，其漂浮于密度大得多的富聚合物相之上(4,5)。合适的聚合物包括制备自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)组分的所谓的“EOPO”聚合物(例如Pluronic?、Tergitol?、Breox?家族)。其它合适的聚合物可包括用含乙氧基的基团二级修饰的纤维素或其它多糖聚合物。从生物分离角度来看，这类单聚合物低盐两相体系的主要缺点为蛋白质趋于不以任何选择性分配到上(贫聚合物)相中。因此已写到“水-EOPO体系因此仅适于疏水分子的分配(例如变性蛋白或富含色氨酸的肽或者用于通过选择性水去除进行的溶液浓缩)”(5)。一个可能的理论解决方案为疏水地修饰EOPO聚合物(6)，然而其可能导致去污性和其它复杂状态。最近发现，EOPO聚合物可直接加入发酵液中，利用发酵温度和盐来实现两相体系的形成，其中细胞碎片会集中在相界面而诸如蛋白质等可溶性物质会分配到贫聚合物相中，在所述相中其可随后容易地进行过滤和色谱分离(4)。一般而言此项工作聚焦于与重组蛋白相关的发酵以及具体而言聚焦于单克隆抗体生产。蛋白质沉淀尽管已提出将絮凝和沉淀(在本文中认为等同的术语)用于细胞碎片去除(2)，但它们亦对加工生物过程原料具有某些吸引力，所述生物过程原料使用离心随后过滤的经典方法预澄清(1,2,7-12)。在所述情况下，靶标纯化可能受到诸如宿主细胞蛋白质(HCP)等污染物沉淀的影响。幸运的是大多数单克隆抗体以及血液中许多天然存在的抗体在pH 7时带净正电荷，而许多HCP和核酸污染物带净负电荷(7)。因此聚阳离子聚合物可用于使许多HCP和核酸污染物沉淀，将带净正电荷的靶单克隆抗体(Mab)蛋白留在溶液中(8,10)。或者可能希望使用带净负电荷的聚合物使带净正电荷的Mab靶标沉淀并将带净负电荷的蛋白质和核酸留在溶液中(7-9)。在两种情况下均需要某种形式的过滤、离心或其它方法以从上清液中分离沉淀(11)。将抗体或其它靶蛋白沉淀的一个优点为靶标在沉淀物中可以是相当稳定的，并因此能够在加工期间间歇地储存(12,13)。缺点为分离沉淀物和再溶解靶蛋白(例如用于经由色谱法的后续纯化)可能需要稀释所述蛋白质，其增加处理体积(例如8)。其亦可能需要用缓冲液再悬浮，所述缓冲液的电导率、pH或其它特性不适应于通过色谱法或其它所需分离方法的加工。最近公开了在诸如柠檬酸钠等盐的存在下使用聚羧酸来纯化诸如Mab和相关抗体片段(Fab)等生物技术蛋白质的方法(7)。在上述实例中，通常控制pH以实现其中待沉淀的物质带有和与其相互作用的沉淀剂相反的净电荷的情况。如果使用诸如硫酸铵等盐将诸如抗体等蛋白质优先沉淀，则类似的考虑亦适用，再次利用pH的控制来确保抗体带有与主要污染物相反的净电荷(11)。这有助于确保蛋白质在其中其为电荷中性的复合物中缔合。当沉淀剂不带电时，例如在溶剂如乙醇或中性(不带电的)聚合物(例如聚乙二醇)的情况下，控制溶液pH以匹配靶蛋白的等电电荷的pH (pI)常常非常有效(12)。这是因为沉淀剂通常结合水分子并减少靶标溶剂化。乙醇(14,15)和盐(22)均已用于通过序贯沉淀将复杂的蛋白质混合物分离成数个级分，其中随着沉淀剂的浓度增加，将一个接着一个的蛋白质级分沉淀并回收。这可能是因为a)不同的蛋白质在不同的沉淀剂浓度下沉淀和b)一旦某种蛋白质已沉淀，其在沉淀剂浓度进一步增加时仍不溶解。然而如在(8,10)中未将使用带电聚合物的沉淀用于通过序贯沉淀的分级分离，因为在加入过量的沉淀剂聚合物后沉淀物趋于再溶解(8,9,10)。此行为使得当两种或更多种靶蛋白表现出显著不同的溶解性时，基本上不可能控制序贯沉淀过程。血浆蛋白分级分离血浆为相对廉价的治疗用蛋白质的宝贵来源；尤其是在发展中国家。每年数十亿美元的血浆蛋白被分离并销售用于治疗用途。主要的关注蛋白质为以相当高浓度在血浆中高丰度的蛋白质并包括白蛋白、纤维蛋白原和各种免疫球蛋白，例如属于IgG、IgA和IgM类的免疫球蛋白。然而诸如凝血因子V、VII、VIII、IV和冯维勒布兰德因子(vWF)，以及转铁蛋白、纤连蛋白和α-1-抗胰蛋白酶等其它蛋白质，有日渐增长的商业重要性(14,15)。表1. 一些高丰度的人血浆蛋白蛋白质Mw(kDa)pI血浆(g/l)血清白蛋白695.635-55免疫球蛋白145-1906.5-9.514纤维蛋白原3405.1-6.31.5-3转铁蛋白805.6-6.02.3因子VIII2805-60.20一般而言将捐献的血液离心以产生富含细胞的级分和血浆。对于大规模离心和无菌的需求可限制这类过程的灵活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自血浆的样品中分离至少第一和第二蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：a)在容器中提供血浆的样品，b)向所述血浆中加入多元酸和盐，导致第一蛋白质沉淀物的形成，并分别回收所述第一蛋白质沉淀物和第一上清液，c)向所述第一上清液中加入多元酸和/或盐，导致第二蛋白质沉淀物和第二上清液的形成，并单独回收所述第二蛋白质沉淀物，其中所述第一蛋白质沉淀物包含所述第一蛋白质的浓缩物以及所述第二蛋白质沉淀物包含所述第二蛋白质的浓缩物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.16 SE 1150842-11. 一种自血浆的样品中分离至少第一和第二蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在容器中提供血浆的样品，
b)向所述血浆中加入多元酸和盐，导致第一蛋白质沉淀物的形成，并分别回收所述第一蛋白质沉淀物和第一上清液，
c)向所述第一上清液中加入多元酸和/或盐，导致第二蛋白质沉淀物和第二上清液的形成，并单独回收所述第二蛋白质沉淀物，
其中所述第一蛋白质沉淀物包含所述第一蛋白质的浓缩物以及所述第二蛋白质沉淀物包含所述第二蛋白质的浓缩物。
2. 依照权利要求1的方法，其中所述第一蛋白质为纤维蛋白原。
3. 依照任何前述权利要求的方法，其中所述第二蛋白质为免疫球蛋白，例如免疫球蛋白G。
4. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤b)中所述血浆包含50-250 mmol/L、例如50-100 mmol/L的盐。
5. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤b)中以这样的量添加所述多元酸，所述量得到至少3%重量、例如4-10%重量或4-5%重量的在所述血浆中的总多元酸浓度。
6. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中以这样的量添加所述多元酸，所述量得到等于或高于步骤b)中的多元酸浓度的在所述第一上清液中的总多元酸浓度，所述总多元酸浓度为至少4%重量，例如介于5-15%重量或者5-8%重量之间。
7. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中所述第一上清液包含50-250 mmol/L、例如50-100 mmol/L的盐。
8. 依照任何前述权利要求的方法，其中所述多元酸选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯基磺酸、聚苯乙烯磺酸、羧甲基葡聚糖和羧甲基纤维素。
9. 依照任何前述权利要求的方法，其中所述盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或其任何组合。
10. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤b)和/或c)中所述pH介于4-9之间，例如介于6-8之间。
11. 依照任何前述权利要求的方法，其中步骤b)和/或步骤c)中的温度介于0-40℃之间，例如介于4-20℃之间。
12. 依照任何前述权利要求的方法，其中在步骤c)中所述第二蛋白质沉淀物包含基本上所有的来自血浆的残留蛋白质。
13. 依照任何前述权利要求的方法，其中步骤c)进一步包括回收第二上清液以及进一步包括步骤d)：向所述第二上清液中加入多元酸和/或盐，导致包含第三蛋白质浓缩物的第三蛋白质沉淀物的形成，并回收所述第三蛋白质沉淀物。
14. 依照权利要求13的方法，其中所述第三蛋白质为白蛋白。
15. 依照任何前述权利要求的方法，其中所述血浆是人血浆或动物血浆，例如牛血浆或马血浆。
16. 依照任何前述权利要求的方法，其进一步包含病原体灭活或去除的步骤。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：J范阿斯蒂内，M伯格，J克杰宁，J沙纳加，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE