一种测定血浆中5,6-二氢-7,8-二甲基-4,5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆中5，6‑二氢‑7，8‑二甲基‑4，5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测血浆样品，加入一定量的无机酸酸化，酸化后的血浆样品加入有机溶媒沉淀蛋白，高速离心，取上清液加入一定量的去离子水，混匀后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中5，6‑二氢‑7，8‑二甲基‑4，5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸的浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物分析
，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法。
技术介绍
瑞吡司特是抗变态反应药，在体内能迅速脱脂化为活性代谢产物5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸(亦称MY-1250)，通过MY-1250抑制组胺、过敏性慢反应物质、血小板激活因子等化学介质的释放而发挥抗哮喘作用。支气管哮喘患者口服瑞吡司特，能抑制抗原引起的肺功能下降和皮肤过敏反应，临床上主要用于支气管哮喘的预防和治疗。目前关于人体口服瑞吡司特片或颗粒后血浆中活性代谢产物MY-1250的测定方法没有文献报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法。本专利技术采用的技术方案是：一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入盐酸溶液酸化，加入内标左乙拉西坦溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离；色谱柱为AgilentZORBAXEclipseC18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L-1醋酸铵水溶液，水相中按照体积比含有0.02％氨水；梯度洗脱：0-8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6-9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7-13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min-1；进样量：50μL；(3)质谱测定：条件包括：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min-1；气帘气CUR：35L·min-1；离子源Gas1：65L·min-1；离子源Gas2：70L·min-1；检测对象的离子选择通道：MY-1250，[M+H]+，m/z286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；内标左乙拉西坦，[M+H]+，m/z171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP10；(4)计算：采用内标法，以5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸和内标左乙拉西坦的峰面积比值代入标准曲线方程计算5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度。优选的，步骤(1)中，于1.5mL塑料离心管中精密加入血浆样品600μL，精密加入12μL盐酸溶液(5mol·L-1)，精密吸取酸化后的受试者血浆样本204μL，精密加入内标400ng·mL-1左乙拉西坦溶液50μL，旋涡10s，加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心5min。吸取400μL上清液至进样瓶中，加入800μL水，涡旋混匀，进样测定。优选的，所述的血浆为口服瑞吡司特片或颗粒后的血浆。优选的，所述血浆为人或动物的血浆。需要指出的是：其中，所述的血浆为口服瑞吡司特片或颗粒后的血浆。本专利技术方法重点是保护口服瑞吡司特片或颗粒后，血浆内MY-1250的检测方法，从而为研究MY-1250的体内代谢奠定基础。有益效果：本专利技术方法与现有技术相比，具有如下优势：(1)预处理方法简便：血浆样品酸化后，有机溶剂沉淀蛋白，适用于常规测定。(2)专属性强：采用AgilentZORBAXEclipseC18(4.6×100mm，3.5μm)色谱柱作为固定相；甲醇和水相(6mmoL·L-1醋酸铵水溶液，含0.02％氨水(％))作为流动相，梯度洗脱：0-8.5min，水相∶甲醇(75∶25)；8.6-9.6min，水相∶甲醇(5∶95)；9.7-13.0min，水相∶甲醇(75∶25)；MY-1250保留时间为7.9min左右；内标左乙拉西坦保留时间为3.05min左右，13分钟完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。(3)灵敏度高：血浆最低定量限为2ng·mL-1。(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为MY-1250的临床血药物浓度测定提供依据，服务于新药研究开发及临床应用。本方法的血浆标准曲线线性范围为2～1500ng·mL-1，批内和批间精密度RSD均小于10％。附图说明图1为质谱图。其中，A为人空白血浆的质谱图，B为人空白血浆加入标准品后的质谱图，C为人空腹口服瑞吡司特片150mg后2h血浆样品的质谱图。注：图中MY-1250[M+H]+，m/z286.1/198.2，保留时间为7.9min左右；内标I.S.[M+H]+，m/z171.3/126.2，保留时间为3.05min左右。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例1：人血浆中MY-1250浓度的测定。一、实验材料与仪器MY-1250对照品：由河南辅仁堂制药有限公司提供，批号：20140501D；左乙拉西坦对照品：由浙江华海药业股份有限公司提供，批号：201308-2；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(MerckCompany)；氨水、醋酸铵：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸：分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)。API4000LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司)，色谱工作站：Analyst1.6；梅特勒XS105DU电子天平(瑞士梅特勒公司)；EppendorfCentrifuge5424R高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；KDC-2042型低速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；MilliporeDrict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。二、液质条件1.液相色谱条件色谱柱为AgilentZORBAXEclipseC18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L-1醋酸铵水溶液，水相中按照体积比含有0.02％氨水；梯度洗脱：0-8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6-9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7-13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min-1；进样量：50μL；2.质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min-1；气帘气CUR：35L·min-1；离子源Gas1：65L·min-1；离子源Gas2：70L·min-1；检测对象的离子选择通道：MY-1250，[M+H]+，m/z286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；内标左乙拉西坦，[M+H]+，m/z171.3/126.2，DP2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定血浆中5，6‑二氢‑7，8‑二甲基‑4，5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入盐酸溶液酸化，加入内标左乙拉西坦溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离；色谱柱为Agilent ZORBAX EclipseC18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L‑1醋酸铵水溶液，水相中按照体积比含有0.02％氨水；梯度洗脱：0‑8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6‑9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7‑13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min‑1；进样量：50μL；(3)质谱测定：条件包括：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min‑1；气帘气CUR：35L·min‑1；离子源Gas1：65L·min‑1；离子源Gas2：70L·min‑1；检测对象的离子选择通道：MY‑1250，[M+H]+，m/z286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；内标左乙拉西坦，[M+H]+，m/z171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP10；(4)计算：采用内标法，以5，6‑二氢‑7，8‑二甲基‑4，5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸和内标左乙拉西坦的峰面积比值代入标准曲线方程计算5，6‑二氢‑7，8‑二甲基‑4，5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入盐酸溶液酸化，加入内标左乙拉西坦溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离；色谱柱为AgilentZORBAXEclipseC18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L-1醋酸铵水溶液，水相中按照体积比含有0.02％氨水；梯度洗脱：0-8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6-9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7-13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min-1；进样量：50μL；(3)质谱测定：条件包括：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min-1；气帘气CUR：35L·min-1；离子源Gas1：65L·min-1；离子源Gas2：70L·min-1；检测对象的离子选择通道：MY-1250，[M+H]+，m/z286.1/198.2，DP106，EP...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蒙，张全英，黄明，宗顺麟，周文佳，
申请(专利权)人：苏州大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32