鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了诊断鸭坦布苏病毒病的试剂盒和抗鸭坦布苏病毒病疫苗。本发明专利技术的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，不仅可以作为诊断抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体，而且还可以作为鸭坦布苏病毒病的亚单位疫苗接种动物诱导产生中和抗体，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白及其应用。
技术介绍
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（DuckTembusuVirus,DTMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的传染病。2010年，鸭坦布苏病毒病在我国南方部分地区首次发生，之后蔓延到全国大部分鸭养殖地区。其主要临床上表现为高热、食欲废绝、产蛋下降甚至停止，死亡率可达5%～10%。该病传播迅速且发病范围广，给我国蛋鸭和种鸭养殖造成了极大经济损失。鸭坦布苏病毒（DTMUV）属于黄病毒科、黄病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA，核苷酸长度约为11kb，含有单一的开放阅读框，编码结构蛋白（C、PrM和E）和非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）。对于黄病毒的研究表明，E蛋白是黄病毒主要表面结构蛋白，包含许多与宿主嗜性、宿主细胞膜融合及宿主细胞表面受体结合相关的抗原表位。根据其功能不同，E蛋白分为三个结构域（I，II和III），而成免疫球蛋白样的第三结构域（EDIII）位于病毒最外层，在介导病毒与宿主受体结合中具有重要的作用，同时也是诱导中和抗体的优势表位区域。鸭坦布苏病毒与其他黄病毒一样，具有相似的E蛋白结构。在黄病毒的研究中，对EDIII的表达和功能研究，对于病毒与宿主细胞的相互作用、以及临床诊断和亚单位疫苗研究具有重要意义。鸭坦布苏病毒病是一种新发传染病，目前，对于该病的诊断缺乏有效的诊断抗原，而且，对于该病的预防也无疫苗可用。以大肠杆菌为宿主的原核表达系统，由于其繁殖快，成本低等优点而被广泛使用。然而密码子对于宿主具有偏嗜性，不同宿主密码子的使用频率不同，经常会影响异源基因在宿主中的表达。另外，对于目的蛋白的表达，表达载体的选择也很重要，选择合适的表达载体使目的蛋白获得高效、可溶性的表达，对于目的蛋白后续的研究和应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决目前针对鸭坦布苏病毒病缺乏有效的诊断抗原和疫苗的技术问题，提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白是根据大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的核苷酸序列进行优化后获得的可溶性重组蛋白，该可溶性重组蛋白不仅可以作为诊断抗原检测鸭坦布苏病毒病抗体，而且还可以作为鸭坦布苏病毒病的亚单位疫苗接种动物诱导产生中和抗体。此外，还需要提供一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，该重组蛋白具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组载体，包含：编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列，所述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列是按照大肠杆菌偏好性密码子进行优化后的核苷酸序列，该优化序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述重组载体的空载体为pCold-TF原核表达载体，使目的蛋白与可溶性的载体蛋白融合表达，能获得可溶性的重组蛋白。在本专利技术的另一方面，还提供了一种由上述重组载体经表达而制得的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。在本专利技术的另一方面，还提供了一种诊断鸭坦布苏病毒病的试剂盒，包含上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。优选的，所述试剂盒还包含ELISA酶标板、酶标二抗、酶底物液，其中酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭二抗。在本专利技术的另一方面，还提供了一种抗鸭坦布苏病毒病疫苗，包含上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白。在本专利技术的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，包含：与佐剂或药用载体混合上述抗鸭坦布苏病毒病疫苗。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备诊断鸭坦布苏病毒病的产品中的应用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白在制备预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗中的应用。本专利技术的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，是按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的核苷酸序列进行优化后获得的高表达重组蛋白EDIII，而且，由于选用pCold-TF载体，使目的蛋白与可溶性的载体蛋白融合表达，获得的重组蛋白EDIII是可溶性的。WesternBlot和间接ELISA实验证实，本专利技术鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应，可作为鸭坦布苏病毒病的诊断抗原来检测鸭坦布苏病毒病抗体。纯化的本专利技术鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白免疫BLAB/c小鼠和鸭子可诱导产生中和抗体，说明本专利技术鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白还可以作为鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的候选。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域核苷酸密码子优化前的序列（EDIII）和优化后的序列(optiEDIII)对比图；图2是本专利技术实施例1构建的重组质粒用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定结果图；图3是本专利技术实施例1表达的重组蛋白和纯化后的重组蛋白SDS-PAGE分析图；图4是本专利技术实施例1用鸭坦布苏病毒血清(A)和His单抗(B)检测重组蛋白的WesternBlot结果图；图5是本专利技术实施例2用重组蛋白EDIII作为间接ELISA的包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体结果图；图6是本专利技术实施例3用间接ELISA检测重组蛋白EDIII免疫小鼠血清结果柱状图；图7是本专利技术实施例3用间接免疫荧光试验检测重组蛋白EDIII免疫小鼠血清结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。为了获得有效的针对鸭坦布苏病毒病的诊断抗原和疫苗，本专利技术按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ核苷酸序列进行了优化，即把目的基因中大肠杆菌稀有的密码子改变为大肠杆菌喜好的密码子，优化序列经合成后再利用大肠杆菌表达系统高效表达了E蛋白的第三结构域，重组表达的蛋白呈可溶性。WesternBlot和间接ELISA实验证实重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应，可作为鸭坦布苏病毒病的诊断抗原来检测鸭坦布苏病毒病抗体。纯化的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白免疫BLAB/c小鼠和鸭子可诱导产生中和抗体，可作为鸭坦布苏病毒病亚单位疫苗的候选。实施例1鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、鉴定分析与纯化1.病毒株、质粒和实验动物DTMUV奉贤分离株（FX2010）为本研究室分离、鉴定及保存；pCold-TF载体为TaKaRa公司产品；DF-1细胞为本实验室保存；DTMUV的鸭阳性血清和DTMUVE蛋白的单克隆抗体（Mab）1F5由本研究室制备并保存；6周龄雌性BLAB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。2.主要试剂限制性内切酶、蛋白Marker本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种重组载体，其特征在于，包含：编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列，所述鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述编码鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域蛋白的基因序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的空载体为pCold-TF原核表达载体。5.一种由权利要求2所述重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽君，李国新，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31