一种重组慢病毒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种重组慢病毒及其应用，所述重组慢病毒包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体主要包括信号肽、抗原识别区、跨膜区、胞内共刺激信号传导域和CD3ζ信号传导域串联构成；其中，所述胞内共刺激信号传导域主要包括人TLR2胞内区。本发明专利技术制备的GPC3 CAT T细胞对肝癌细胞具有强烈的细胞杀伤效应，且高表达Th1细胞因子，极大程度刺激非CAR T细胞引起的肿瘤杀伤效应，可有效防止GPC3‑肿瘤细胞的逃逸和潜在复发威胁，且表达此嵌合抗原受体的T细胞能最大程度的杀伤肿瘤细胞，对正常组织的伤害程度很小，能突破肿瘤免疫抑制微环境，从而对实体瘤具有更好的疗效。

Recombinant lentivirus and its application

The invention relates to the field of immunotherapy of tumors, especially relates to a recombinant lentivirus and its application, the recombinant lentivirus containing the chimeric antigen receptor, the chimeric antigen receptor mainly including signal peptide, antigen recognition region, transmembrane region and intracellular costimulatory signal transduction domain and signal transduction domain CD3 zeta series composition; among them, the intracellular signaling domain including costimulatory TLR2 intracellular domain. The preparation of GPC3 CAT T cells have strong killing effect on hepatocellular carcinoma cells, and high expression of Th1 cytokines, cytotoxic effect greatly stimulated by non CAR T cell tumor, which can effectively prevent the GPC3 escape of tumor cells and the potential threat of the recurrence, and chimeric antigen receptor T cells to the greatest degree of killing tumor cells, damage to normal tissue is very small, can break through the tumor microenvironment of immune suppression, which has better curative effect on solid tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种重组慢病毒及其应用
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种重组慢病毒及其应用，具体为以肿瘤特异靶点GPC3为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)基因定位于人染色体X26.10，参与了细胞分裂、生长、发育以及细胞对生长因子的反应等生命过程。GPC3的功能预期在生物体内的分布有密切关系，在人体的胚胎期，GPC3在胎盘、胚胎肝、胚胎肺和胚胎肾中都有表达。在成人正常组织中，在脑、肝脏、脾脏、胃、肠等均不表达，仅在卵巢、肺部及肾脏等部位有极低水平的表达(HsuHCetal.,1997CancerReseach)。遗传性的GPC3基因突变缺失，Hedgehog信号通路失去负面调控，引起Simpson-Golabi-Behmel(SGBS)综合征(CapurroMIetal.,2008DevCell)。SGBS综合征是一种X染色体连锁遗传病，主要特征是巨舌、多指(趾)、肋骨及脊柱畸形、肌张力低下等，同时胚胎性肿瘤发生的危险性增加。研究报道，GPC3在肝癌(CapurroMetal.,2003Gastroenterology)、肾细胞癌(ValsechiMCetal.,2014BMCCancer)、卵巢癌(MaedaDetal.,2009ModPathol)、肺癌(LinQetal.,2012ModPathol)、黑色素瘤(NakatsuraTetal.,2004ClinCancerRes)中特异性高表达。GPC3为肿瘤相关抗原，通过上调Wnt信号通路的自分泌和旁分泌产物，刺激肝癌细胞生长(LaiJPetal.,2010Hepatology)。同时，GPC3还是一个潜在的肿瘤抑制基因。在卵巢癌细胞系中，GPC3基因表达常常会被甲基化沉默(LinHetal.,1999CancerRes)。通过基因表达分析，发现GPC3在肺腺癌(相对于正常肺癌细胞)、吸烟人群(相对于非吸烟人群)肺组织中高表达(KimHetal.,2003AmJRespirCellMolBiol)。GPC3在胰腺导管腺癌中高表达(相对于正常胰腺组织)，与肿瘤发生、发展、预后有关，是胰腺导管腺癌诊断的候选标记物(YaoHetal.,2016CancerBiomark)。作为检出早期肝癌的分子标志物，GPC3在肝癌中特异性呈高表达状态，在不典型增生结节及其它肿瘤中检测不到；且敏感性高，能够在肝癌发生的早期被检出。GPC3-AS1(ThelncRNAglypican3antisensetranscript1)，即GPC3反义转录子非编码长RNA，在肝癌中显著高表达，且其表达水平与GPC3表达、肿瘤生长、血管浸润、预后等有关联(ZhuXTetal.,2016FEBSJ)。GPC3参与肿瘤组织中的炎症反应，GPC3可上调F4/80+CD86+巨噬细胞数量，引起GPC3特异性CD8+T细胞免疫反应，延长小鼠生存期(LuoCetal.,2014OncolRep)。通过GPC3多肽疫苗，激活CTL细胞对GPC3高表达肝癌细胞的杀伤作用，治疗肝癌病人处于二期临床试验(SawadaYetal.,2016Oncoimmunology)。临床研究报道，可利用GPC3特异性树突状细胞疫苗治疗肝癌，激活GPC3+肝癌细胞的识别杀伤(TadaFetal.,2012IntJOncol)。相对于共刺激因子组合CD28、CD28联合41BB，GPC3-41BB嵌合抗原受体T细胞具有更强的扩增和抗肿瘤潜能(LiWetal.,2016HumGeneTher)。现有技术中以GPC3为肿瘤的靶点，主要通过GPC3肽段疫苗、特异性靶向GPC3过继性免疫、嵌合抗原受体T细胞等。而GPC3疫苗主要在肿瘤预防和肿瘤早期可起到一定的作用，而往往肝癌确诊的时候都是肝癌中晚期，GPC3疫苗往往效果不明显。GPC3抗原特异性的DC-CIK免疫细胞对肿瘤细胞的体内识别杀伤效果比较低，免疫细胞活性较弱。CN102180969A公开了一种抗肝癌活性单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBankaccessionNumber为AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸残基。该专利技术制备了高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性的鼠抗人GPC3-C单克隆抗体。GPC3单克隆抗体可有效抑制肝癌细胞生长和迁移，然而，GPC3抗体容易形成耐药，且能导致GPC3阴性肝癌细胞逃逸，埋下肿瘤复发的威胁。CN105949324A公开了靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途，该嵌合抗原受体含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗GPC3单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区和任选的EGFR序列的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段。该嵌合抗原靶向效果并不十分理想，且肿瘤微环境会影响其治疗效果。
技术实现思路
针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本专利技术提供一种重组慢病毒及其应用，本专利技术制备的GPC3CATT细胞对肝癌细胞具有强烈的细胞杀伤效应，且高表达Th1细胞因子，极大程度刺激非CART细胞引起的肿瘤杀伤效应，可有效防止GPC3-肿瘤细胞的逃逸和潜在复发威胁。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体主要包括信号肽、抗原识别区、跨膜区、胞内共刺激信号传导域和CD3ζ信号传导域串联构成；其中，所述胞内共刺激信号传导域主要包括人TLR2胞内区。本专利技术中，通过在GPC3CAR分子中引入人TLR2(TOLLLIKERECEPTOR2)胞内信号域，构建成的GPC3CART细胞，发现其免疫细胞因子分泌偏向于Th1类型，对肝癌细胞具有强烈的细胞杀伤效应，且高表达Th1细胞因子，极大程度刺激非CART细胞引起的肿瘤杀伤效应，可有效防止GPC3-肝癌细胞的逃逸和潜在复发威胁。根据本专利技术，所述人TLR2胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述人TLR2胞内区的核酸序列如SEQIDNO.2所示。所述人TLR2胞内区的氨基酸序列(SEQIDNO.1)如下：QAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS.所述人TLR2胞内区的核酸序列(SEQIDNO.2)如下：5-CAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体主要包括信号肽、抗原识别区、跨膜区、胞内共刺激信号传导域和CD3ζ信号传导域串联构成；其中，所述胞内共刺激信号传导域主要包括人TLR2胞内区。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体主要包括信号肽、抗原识别区、跨膜区、胞内共刺激信号传导域和CD3ζ信号传导域串联构成；其中，所述胞内共刺激信号传导域主要包括人TLR2胞内区。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述人TLR2胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；优选地，所述人TLR2胞内区的核酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原识别区为特异性识别结合GPC3抗原的区域，优选为抗GPC3抗体胞外段。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为人IgM信号肽或人CD8α信号肽，优选为人IgM信号肽；优选地，所述的跨膜区为人CD28跨膜区或人CD8跨膜区，优选为人CD28跨膜区。5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激信号传导域还包括人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人CD27胞内区、人CD28胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区、人PD-1胞内区、人ICOS胞内区、人淋巴细胞功能相关抗原1胞内区、人CD2胞内区、人CD7胞内区、人LIGHT胞内区、人NKG2C胞内区、人B7-H3胞内区或人CD83胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人4-1BB胞内区或CD28胞内区；优选地，所述胞内共刺激信号传导域为人41BB胞内区或人CD28胞内区和人TLR2胞内区串联构成。6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人IgM信号肽、抗GPC3抗体、人CD28跨膜区和胞内区、人TLR2胞内区和人CD3ζ信号传...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44