具有高药物负载的抗体‑药物缀合物制造技术

本发明专利技术提供了具有高药物‑抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶‑介导的抗体‑药物缀合物，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)包括胺供体单元、接头和试剂部分的胺供体试剂，其中所述DAR是至少约5。本发明专利技术还提供了这种较高药物负载的抗体‑药物缀合物的制备方法和使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2014年4月25日提交的61/984,645号、于2014年7月24日提交的62/028,731号、于2015年1月25日提交的62/103,999号，和于2015年4月14日提交的62/147,293号美国临时申请的权益，所有申请均以其整体通过引用并入本文。参考的序列表本申请通过EFS-Web电子提交，并且包括以.TXT格式电子提交的序列表。所述TXT文件包含于2015年4月9日生成的标题为“PC7207805SEQLISTING_ST25.txt”并且具有9KB大小的序列表。包含在这个.TXT文件中的序列表是本申请说明书的一部分，并且在此以其整体通过引用并入本文。
本专利技术主要涉及具有高药物-抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶-介导的抗体-药物缀合物，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)胺供体试剂，包括胺供体单元、接头和试剂部分。本专利技术还涉及此类抗体-药物缀合物的制备方法和使用方法。
技术介绍
抗体治疗在具有各种病变(例如癌症和免疫疾病)的患者中提供靶向的治疗处理，并且因此在生物研究中具有重要作用。现已开发出不同方法的靶向抗体治疗，包括抗体-药物缀合物(ADC)。参见例如Doronina等人，Bioconj.Chem.19:1960-1963(2008)；和Junutula等人，Nat.Biotechnol.26:925-932(2008)。在抗体-药物缀合物(即免疫缀合物)的情况下，通常将细胞毒性的小分子(药物)连接或缀合至抗体，以将药物部分靶向地局部递送至肿瘤。用于ADC的常规缀合方法包括经赖氨酸侧链胺或经通过还原链内二硫键而活化的半胱氨酸巯基基团的化学修饰。(布妥昔单抗vedotin)和(ado-曲妥珠单抗emtansine)是使用这些常规方法的ADC的两个实例。参见例如Tanaka等人，FEBSLetters579:2092-2096(2005)；和Strop,Bioconj.Chem.,(inpress)(2014)。传统的ADV缀合方法倾向于产生在非特异位点连接不同数量的药物，具有不同的安全特征、功效和清除率的异质混合物。参见例如Wang等人，ProteinSci.14:2436-2446(2005)；和FirerandGellerman,J.ofHematology&Oncology,5:70(2012)。现已报道每个抗体具有2-4个药物的ADC通常在体内功效；可容许性和药代动力学方面比负载更多(例如每个抗体多于4个药物)的缀合物更好，产生更高的治疗指数。参见例如Hamblett等人，ClinicalCancerResearch,10:7063-7070(2004)。近期还开发出使用转谷氨酰胺酶以制备抗体-药物缀合物的酶促方法。转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13；蛋白质-谷氨酰胺：γ-谷氨酰转移酶；蛋白质-谷氨酰胺：胺γ-谷氨酰转移酶；CAS80146-85-6)属于向伯胺添加酰基的酶家族，其中肽结合的γ-谷氨酰残基的γ-氨甲酰基团是酰基供体，并且所述伯胺是酰基受体和胺供体。使用转谷氨酰胺酶的抗体和药物缀合提供了高选择性、简化的反应程序和温和的反应条件的优点。参见例如Strop等人，Chemistry&Biology,20:161-167(2013)；和Farias等人，Bioconj.Chem.25(2):240-250(2014)。US20130230543和US2013/0122020描述了转谷氨酰胺酶-介导的位点特异性的抗体和小分子的缀合。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以其整体通过引用并入本文，对所有目的均达到如同特别且单独地指出每篇单独的出版物、专利和专利申请以如此通过引入并入相同的程度。在一篇或多篇并入的文献或相似材料与本申请不同或矛盾的情况下，包括但不限于限定的术语、术语使用或描述的技术等，以本申请为准。
技术实现思路
本专利技术主要涉及具有高药物-抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶-介导的位点特异性的抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(即未经工程化的天然谷氨酰胺，例如在可变结构域、CDR中的谷氨酰胺等)，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)胺供体试剂，包括胺供体单元、接头和试剂部分。本专利技术人意外地发现与利用马来酰亚胺连接的常规较高负载的ADC相比，这些较高负载的位点特异性ADC(例如，至少5或更高的DAR)具有更高的体内功效和更少的非特异性体外细胞毒性。本专利技术人已进一步发现这些较高负载的位点特异性ADC：1)在小鼠中具有与未缀合的野生型抗体相似的药代动力学特征并且在大鼠中具有改进的药代动力学特征；并且2)保持与相似负载的常规ADC相当的安全性特征。一方面，本专利技术提供了具有下式的ADC：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。在一些实施方式中，抗体-(T-(X-Y-Za)b)c的T包含至少1个内源谷氨酰胺(例如，天然或反应性的内源谷氨酰胺)。在一些实施方式中，所述反应性的内源谷氨酰胺是通过去糖基化(例如，酶促去糖基化)或通过抗体中另一种氨基酸的氨基酸修饰(例如，在297位的氨基酸取代，例如N297Q或N297A(EU编号方案))而成为反应性的。在一些实施方式中，本专利技术中ADC(例如，转谷氨酰胺酶-介导的较高负载的ADC)的抗体进一步包含在K222、K340和/或K370位的第二氨基酸修饰(例如，K222R、K340R和/或K370R)。在一些实施方式中，所述ADC的胺供体试剂(X-Y-Z)位点特异性地缀合至在选自以下的至少一个或多个位点的含谷氨酰胺的标签：1)任一轻链、重链或轻链和重链二者的羧基末端；2)任一轻链、重链或轻链和重链二者的氨基末端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385(例如，如在表1中列出)，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到抗体中，或代替抗体中一个或多个内源氨基酸。在一些实施方式中，本专利技术的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中胺供体试剂(X-Y-Z)位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；和b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签，并且其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下式的抗体‑药物缀合物：抗体‑(T‑(X‑Y‑Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X‑Y‑Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、所述内源谷氨酰胺和/或所述反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1‑6的整数；b是1‑6的整数；c是1‑20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物‑抗体比例)是至少约5。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.25 US 61/984,645;2014.07.24 US 62/028,731;1.一种具有下式的抗体-药物缀合物：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、所述内源谷氨酰胺和/或所述反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。2.权利要求1的缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体，双抗体或抗体片段。3.权利要求1或2的缀合物，其中T包含至少1个内源谷氨酰胺或反应性内源谷氨酰胺。4.权利要求1-3中任一项的缀合物，其中所述反应性内源谷氨酰胺是通过所述抗体中的去糖基化或通过另一种氨基酸的氨基酸修饰而成为反应性的。5.权利要求4的缀合物，其中所述另一种氨基酸修饰是在297位(EU编号方案)的取代。6.权利要求5的缀合物，其中所述取代是在297位从天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)或从N至丙氨酸(A)。7.权利要求5的缀合物，其中所述抗体进一步包含在K222、K340和/或K370位的第二氨基酸修饰。8.权利要求7的缀合物，其中所述第二氨基酸修饰是赖氨酸至精氨酸的取代。9.权利要求1-8中任一项的缀合物，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至在所述抗体的选自以下的至少一个或多个位点的所述含谷氨酰胺的标签：1)任一轻链、重链，或轻链和重链二者的羧基末端；2)任一轻链、重链或轻链和重链二者的氨基末端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385位，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中一个或多个内源氨基酸。10.权利要求8的缀合物，其包含：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；和b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至所述抗体的轻链羧基末端的所述含谷氨酰胺的标签，其中所述药物-抗体比例是约5-7。11.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在选自以下的一个或多个位点的所述含谷氨酰胺的标签：S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和G385，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中一个或多个内源氨基酸，并且其中所述药物-抗体比例是至少约6。12.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至位于所述抗体的重链羧基末端的所述含谷氨酰胺的标签，并且其中所述药物-抗体比例是约6-9。13.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至插入到所述抗体重链中氨基酸位点T135之后的所述含谷氨酰胺的标签，并且其中所述药物-抗体比例是约6-9。14.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·施特罗普，K·A·德拉里亚，M·多里沃尔斯卡，D·L·福莱蒂，R·G·杜申，D·L·谢尔顿，A·拉吉帕尔，
申请(专利权)人：瑞纳神经科学公司，辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US