包含改进的IL-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法技术

本发明专利技术公开了核酸分子和组合物，其包含：编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，和/或编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列。本发明专利技术还公开了还包含编码免疫原的核酸序列的核酸分子和组合物。本发明专利技术公开了调节免疫应答的方法以及诱导针对免疫原的免疫应答的方法。本发明专利技术还公开了治疗性和预防性疫苗接种方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含改进的IL-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗 剂及其使用方法
本专利技术涉及编码人IL-12的改进基因构建体以及包含所述构建体的核酸分子。本 专利技术还涉及包含编码人11-12的核苷酸序列的改进表达载体、疫苗和免疫治疗剂，以及涉 及它们的使用方法。 专利技术背景 免疫治疗是指调节人的免疫应答从而赋予所需的疗效。免疫治疗剂是指施用给个 体时调节个体的免疫系统，足以最终减轻与不良免疫应答相关的症状，或通过增强所需的 免疫应答而最终缓解症状的那些组合物。在一些情况下，免疫治疗是疫苗接种方案的一部 分，其中向个体施用疫苗，该疫苗将个体暴露于免疫原，进而使该个体产生针对该免疫原的 免疫应答，在此类情况下，免疫治疗剂增强免疫应答和/或选择性增强免疫应答的一部分 (例如细胞应答或体液应答），这是治疗或预防特定病症、感染或疾病所需的。 在设计疫苗时，已认识到，在接种疫苗的个体的细胞中产生靶抗原的疫苗可有效 诱导免疫系统的细胞免疫应答。具体地讲，减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗以及 DNA疫苗各自能在接种疫苗的个体的细胞中产生抗原，从而导致诱导免疫系统的细胞免疫 应答。另一方面，只包含蛋白的杀死或灭活疫苗和亚单位疫苗不能诱导良好的细胞免疫应 答，虽然它们能诱导有效的体液应答。 细胞免疫应答通常是提供抵御病原体感染的保护力和提供治疗病原体感染、癌症 或自身免疫疾病的有效免疫介导疗法所必需的。因此，在接种疫苗的个体的细胞中产生靶 抗原的疫苗诸如减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗和DNA疫苗通常是优选的。 需要可在人体中诱导强T细胞和B细胞免疫的疫苗方法。在一系列其他问题之中， 最近对减毒、疫苗制造复杂性、血清学干扰（如在HIV STEP试验中所观察到的）的关注进一 步强调了这一问题。在非人灵长类模型中以及在人类临床试验中，作为疫苗平台的简单质 粒DNA未能诱导支持商业开发工作的令人满意的免疫原性水平。在面对面的直接比较中， 一些基于裸质粒的疫苗未能诱导与其病毒载体对应物（包括常用的腺病毒血清型5 (Ad5) 平台）所诱导的相当的细胞或体液应答。 作为独立疫苗接种方法的DNA疫苗技术的开发及其在当前初免平台中的实用性 将受益于开发增强其免疫效力的策略。已报道，对密码子和RNA编码序列的操纵以及先导 序列的改变可增强质粒编码的免疫原的表达。此外，形成共有免疫原正尝试着满足广泛免 疫覆盖率以部分考虑病毒多样性的需求。 另外，已采用了其他策略，这些策略关注于通过改进制剂和装置驱动的技术来改 善DNA质粒的物理递送。已报道，在恒河猴中，通过电穿孔（EP)递送的DNA疫苗在用质粒 DNA免疫后增强了抗原特异性干扰素 -γ (IFNY)的产生。 共同递送质粒编码的分子佐剂以增强疫苗诱导的应答是该项专门研究的另一个 重要领域。在非人灵长类动物中得到最好表征的分子佐剂之一是IL-12,这是一种T H1极化 细胞因子，它通过提供初始CD8+T细胞的有效激活和抗原特异性扩增所需的第三信号而 驱动CTL应答。IL-12是包含两个亚单位p35和p40的异源二聚体。已表明其为最令人印 象深刻的免疫增强细胞因子，尤其是在作为DNA疫苗进行工程改造时用于驱动CD8T细胞。 在猕猴中，已表明IL-12是扩展靶向多种抗原的DNA疫苗的细胞免疫效力的高度有效的佐 齐[J。在恒河猴以及在人类中，这种DNA疫苗佐剂均可明显改善由DNA疫苗诱导的免疫应答。 以引用方式并入本文的美国专利5, 723, 127公开了作为疫苗佐剂的IL-12。以引 用方式并入本文的PCT申请PCT/US1997/019502和相应的美国专利申请08/956, 865公开 了包含IL-12编码序列的DNA疫苗和DNA构建体。 仍需要改进的疫苗和免疫治疗剂。需要产生增强的免疫应答的组合物和方法。同 样，虽然某些免疫治疗剂可用于调节患者中的免疫应答，但是仍需要改进的免疫治疗组合 物和方法。仍需要编码IL-12并可用作DNA疫苗策略的一部分的改进构建体。仍需要编码 IL-12并可用作免疫治疗剂的改进构建体。仍需要编码IL-12并可用于实现高水平IL-12 表达的改进构建体。 专利技术概要 本专利技术提供组合物，其包含编码IL-12P35亚单位或其功能片段的核酸序列，以及 编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列。编码IL-12p35亚单位的核酸序列可与SEQ ID N0:1至少98%同源并编码与SEQ ID N0:2至少98%同源的蛋白。编码IL-12p35亚单 位的功能片段的核酸序列可以是与SEQ ID N0 :1至少98%同源的核酸序列的片段并编码 与SEQ ID N0:2的功能片段至少98%同源的蛋白。编码IL-12p40亚单位的核酸序列可与 SEQ ID N0:3至少98%同源并编码与SEQ ID N0:4至少98%同源的蛋白。编码IL-12p40 亚单位的功能片段的核酸序列可以是与SEQ ID NO :3至少98%同源的核酸序列的片段并 编码与SEQ ID N0 :4的功能片段至少98%同源的蛋白。组合物还可以包含编码免疫原的 核酸序列。 本专利技术还提供调节免疫应答的方法。该方法包括向个体施用组合物的步骤，该组 合物包含编码IL-12P35亚单位或其功能片段的核酸序列以及编码IL-12P40亚单位或其功 能片段的核酸序列。 本专利技术还提供诱导针对免疫原的免疫应答的方法。该方法包括向个体施用组合物 的步骤，该组合物包含一定量的编码IL-12P35亚单位或其功能片段的核酸序列以及编码 IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列与编码免疫原的核酸序列的组合。诱导针对免疫 原的免疫应答的方法可以是诱导治疗性免疫应答的方法或诱导预防性免疫应答的方法的 一部分。 附图简述 图 1A 和 1B 显示了坐标图，该图对用 2μ g HuIL12-〇pt 或HuIL12-nonopt(图 1A) 或4yg HuIL12-〇pt和HuIL12-nonopt (图1B)转染的细胞中的人IL-12的表达水平进行 比较。 图2显示了在恒河猴中增强的PSA和PSMA特异性细胞免疫应答。 图3显示了在恒河猴中增强的HBV核心和表面抗原特异性细胞免疫应答。 【具体实施方式】 在本专利技术的一个方面，期望的是，改进的IL-12构建体能改善转录和翻译，包括具 有以下一者或多者：低GC含量的先导序列以增强转录;mRNA稳定性和密码子优化；在某种 程度上消除可能的顺式作用序列基序（即，内部TATA盒）。 在本专利技术的一些方面，期望将改进的IL-12构建体结合到疫苗方案中，作为疫苗 组合物的一部分或作为与疫苗以协调方式递送的单独组合物，以便生成针对疫苗免疫原的 广泛免疫。在本专利技术的一些方面，期望提供改进的IL-12构建体，作为可用于调节个体中的 免疫应答的免疫治疗剂。在本专利技术的一些方面，期望提供改进的IL-12构建体以便提供表 达载体，该表达载体可用于获得高水平的IL-12表达。 本文提供了更高效力的IL-12基因佐剂。这些新的佐剂较以前的IL-12分子具有 若干优点。本专利技术提供了有利于分子分泌并提高核糖体含量的增强的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包含a)编码IL‑12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，以及b)编码IL‑12p40亚单位或其功能片段的核酸序列，其中编码IL‑12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的功能片段以及编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白；并且编码IL‑12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的功能片段以及编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.12 US 61/569,6001. 一种组合物，所述组合物包含a)编码IL-12P35亚单位或其功能片段的核酸序列，以 及b)编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列，其中 编码IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ ID NO :1至少98%同源并 编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO :1至少98%同源的核酸序 列的功能片段以及编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同源的蛋白；并且 编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ ID N0:3至少98%同源并 编码与SEQ ID NO :4至少98 %同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO :3至少98 %同源的核酸序 列的功能片段以及编码与SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白。2. 根据权利要求1所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID N0:1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白；并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4至少98%同源的蛋白。3. 根据权利要求2所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID N0:1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白；并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白。4. 根据权利要求3所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码SEQ ID NO :2 ;并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQIDN0:3至少98%同源并编码SEQID NO :4。5. 根据权利要求2所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID N0:1至少99%同源并编码与SEQ ID NO :2至少99%同源的蛋白；并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID N0:3至少99%同源并编码与SEQ ID NO :4至少99%同源的蛋白。6. 根据权利要求2所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO :1至少99%同源并编码SEQ ID NO :2 ;并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID N0:3至少99%同源并编码SEQ ID NO :4。7. 根据权利要求2所述的组合物，包含： 编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列为SEQ ID N0:1，并且 编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列为SEQ ID NO :3。8. 根据权利要求2所述的组合物，所述组合物被配制成使用电穿孔递送给个体。9. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列 位于与编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列不同的核酸分子上。11. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12P35亚单位的所述核酸序 列位于质粒上，并且编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于不同的质粒上。12. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序 列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上。13. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序 列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的质粒上。14. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序 列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上并可操作地连接到不同 的启动子。15. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序 列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的质粒上并可操作地连接到不同的启 动子。16. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码免疫原的核酸序列。17. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码来自病原体的免疫原的核酸 序列，所述病原体选自：111￥、即￥、!1(^、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、疟疾、人巨细胞 病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。18. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中将编码IL-12p35亚单位的所述核酸 序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列掺入病毒颗粒中。19. 根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码选自IL-15和IL-28的一种或 多种蛋白的核酸序列。20. 根据权利要求1所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少98% 同源的蛋白的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是 与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的 核酸序列。21. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少99% 同源的蛋白的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是 与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4的功能片段至少99%同源的蛋白的 核酸序列。22. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列， 所述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码SEQ ID NO :2的功能片段的核酸序 列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID N0:3至少 98 %同源并编码SEQ ID NO :4的功能片段的核酸序列。23. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列， 所述核酸序列是与SEQ ID NO: 1至少99 %同源并编码SEQ ID NO :2的功能片段的核酸序 列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO :3至少 99 %同源并编码SEQ ID NO :4的功能片段的核酸序列。24. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO :2的功能片段的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)编码SEQ ID NO :4的功能片段的SEQ ID NO :3的片段。25. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列 的SEQ ID NO : 1的片段，和/或b)不含IL-12p40亚单位信号肽的编码序列的SEQ ID NO : 3的片段。26. 根据权利要求25所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列 并连接有编码信号肽的核酸序列的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)不含IL-12p40亚单位 信号肽的编码序列并连接有编码信号肽的核酸序列的SEQ ID NO :3的片段。27. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列 并连接着编码SEQ ID NO :5的核酸序列的SEQ ID NO :1的片段，和/或b)不含IL-12p40 亚单位信号肽的编码序列并连接着编码SEQ ID NO :5的核酸序列的SEQ ID NO :3的片段。28. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID NO : 1的片段，和/或b)编码SEQ ID NO :4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO : 3的片段。29. 根据权利要求28所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID NO : 1的片段，其连接着编码信号肽的核酸序列，和/或b)编码SEQ ID NO :4的 第23-328位氨基酸的SEQ ID NO :3的片段，其连接着编码信号肽的核酸序列。30. 根据权利要求28所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO :2的第23-219位氨基酸 的SEQ ID N0:1的片段，其连接着编码SEQ ID N0:5的核酸序列，和/或b)编码SEQ ID NO :4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO :3的片段，其连接着编码SEQ ID NO :5的核酸序 列。31. 根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同 源的蛋白的核酸序列，其不含IL_12p35亚单位信号肽的编码序列，和/或b)编码IL-12p40 的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列，其不含IL-12p40亚单位信号肽的编码 序列。32. 根据权利要求31所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少98%同 源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码信号肽的编码序列，和/或b)编码IL-12p40 的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO :3至少98%同源并编码与SEQ ID NO :4的功能片段至少98%同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码信号肽的编码 序列。33. 根据权利要求31所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所 述核酸序列是与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2的功能片段至少98% 同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码SEQ ID NO :5的编码序列，和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·B·韦纳，M·P·莫罗，严健，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：美国;US