一种定量检测丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测丝氨酸的方法。丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通过测定340nm波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。本发明专利技术所提出的工艺操作简便、快速，有较为精密和准确的分析性能、抗干扰能力强，能适应绝大多数自动生化分析仪，易于实现自动化，是目前测定丝氨酸的优选方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通过测定340nm波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。本专利技术所提出的工艺操作简便、快速，有较为精密和准确的分析性能、抗干扰能力强，能适应绝大多数自动生化分析仪，易于实现自动化，是目前测定丝氨酸的优选方法。【专利说明】
本专利技术属于氨基酸检测领域，涉及胱硫醚裂解酶法对丝氨酸的定量分析，是试剂检测领域。
技术介绍
丝氨酸是一种不带电荷的极性氨基酸，白色结晶体或结晶性粉末，呈六角形片或柱状晶，易溶于水和甲酸，难溶于乙醇。丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，并且它有助于免疫血球素和抗体的产生，所以丝氨酸在维持健康的免疫系统方面扮演者重要的角色。丝氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体，可用于生化研究。丝氨酸广泛用于配置第三代复方氨基酸输液和营养增补剂，并用于合成多种丝氨酸衍生物，如心血管、抗癌、艾滋病新药及基因工程用保护氨基酸等。此外，丝氨酸具有稳定滴眼液PH值的作用，且滴眼后无刺激性。在化妆品行业中，丝氨酸是一种重要的自然保湿因子(NMF)之一，它能有效保持皮肤角质层的水分，因此是很多高级化妆品中的关键添加剂。2012年12月，英国Beatson癌症研究所的研究人员在一项新研究中证实，丝氨酸是癌细胞相关的一种关键氨基酸，可显著削弱癌细胞的生长和增殖能力。目前，国内外用来检测氨基酸含量的方法，通常有高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法和纸层析-茚三酮显色法。前两种方法或者仪器设备要求高或者衍生步骤繁琐，操作很不方便，而且对于样品多、工作量大的丝氨酸分离提取以及丝氨酸产生菌的筛选来说并不适用。纸层析-茚三酮显色法虽然操作方便、所用仪器较简单，但在氨基酸种类复杂的环境中，对丝氨酸的层析分离和定量分析不够准确。丝氨酸在胱硫醚裂解酶(CBL)的作用下可以生成丙酮酸，丙酮酸测定的反应是乳酸测定的逆反应。在PH7.4条件下，平衡常数非常有利于逆反应(生成乳酸的方向)。通过测定340nm波长处NADH的下降速率，定量丙酮酸含量。此方法优点较多:顺向反应中以NAD+、乳酸为底物都比较稳定，过量乳酸对乳酸脱氢酶(LD)的抑制作用小于过量丙酮酸；逆向反应NADH的用量只有正向反应NAD+的3%，酶促反应速率快于正向反应，所以应用样品量少且可在短时间内完成测定。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供。定量检测丝氨酸的方法，丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶(CBL)作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。优选地，所述的丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，PH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通过测定340nm波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。优选地，，具体步骤如下: I)、配置相关试剂: A、0.5mmol/L丝氨酸标准应用液，B、R1:20mmol/L HEPES 缓冲液，33 KU/L LD,8.9KU/L CBL, pH 7.4，C、R2:50mmol/L Tris,0.416 mmol/L NADH, pH 7.4 ； 2)、根据自动化分析仪的型号、性能设定参数，温度:37°C ;波长:340nm ;样品和标准品各25 ii L，5s后加R1IOO u L，IOs后加R250 u L，每隔28s检测OD34tl,分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率； 3 )、计算样品中丝氨酸含量【权利要求】1.，其特征在于，丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶(CBL)作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的丙酮酸的含量的测定方法为乳酸脱氢酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD+，通过测定340nm波长处NADH下降速率，得到丙酮酸含量。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)、配置相关试剂: A、0.5mmol/L丝氨酸标准应用液，B、R1:20mmol/L HEPES 缓冲液，33 KU/L LD, 8.9KU/L CBL, pH 7.4，C、R2:50mmol/L Tris,0.416 mmol/L NADH, pH 7.4 ； 2)、根据自动化分析仪的型号、性能设定参数，温度:37°C;波长:340nm ;样品和标准品各25 uL，5s后加R11OO u L，1Os后加R250 u L，每隔28s检测OD34tl,分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率； 3)、计算 【文档编号】G01N21/33GK103674873SQ201310591734【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日 【专利技术者】缪刘, 许首芳, 余琳, 王轶雄 申请人:杭州利安生物科技有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测丝氨酸的方法，其特征在于，丝氨酸样品经过胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通过测定生成丙酮酸的含量，定量得到样品中丝氨酸的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：缪刘，许首芳，余琳，王轶雄，
申请(专利权)人：杭州利安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33