酶转化法制备还原型辅酶Ⅰ衍生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶转化法制备还原型辅酶Ｉ衍生物的方法。它是将０．１－５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ↓［２］、５－２００ｍＭ　　ｐＨ为６．５－８．５的磷酸盐缓冲液、０．１－５％氧化型辅酶Ｉ衍生物、０．０３－２％苹果酸或苹果酸盐、１００－５０００Ｕ苹果酸脱氢酶进行酶催化反应，减压，于还原型辅酶Ｉ衍生物的最大吸收峰处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节ｐＨ至８．５－１０．５，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，在浓缩液中加入７－１３倍浓缩液体积的乙醇，静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤２－４次脱水，真空干燥即可。本发明专利技术中的辅酶Ｉ及其衍生物原料在中性反应条件下性质较为稳定，反应时间可以大大延长。时间延长可以降低酶和苹果酸盐的用量，使分离纯化工艺简化；同时辅酶Ｉ及其衍生物在反应时的分解也会降低，使产品质量提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶转化法制备还原型辅酶I衍生物的方法。
技术介绍
氧化型辅酶I与还原型辅酶I向转变时可出现特征性吸收光谱的改变。在一定条件下，可与被测物的浓度呈线性改变，许多化学分析方法是基于这一原理实现的。还原型辅酶I是临床化学分析试剂中普遍使用的一种原料，还原型辅酶I衍生物是指在用其它化学基团取代还原型辅酶I的烟酰胺基团所形成的化合物。还原型辅酶I衍生物有四十多种，目前应用较广的包括还原型3-乙酰吡啶辅酶I、还原型硫代辅酶I等。还原型辅酶I衍生物的化学性质较还原型辅酶I则有了较大的改变，表现为最大吸收峰改变、摩尔吸光值增加、反应Km值改变、溶液稳定性和稳定pH范围大大增加。近年来许多诊断试剂和化学分析试剂已广泛采用还原型辅酶I衍生物作为核心原料。还原型辅酶I衍生物是将还原型辅酶I上的烟酰胺基团用其它基团取代。用硫代烟酰胺基团取代烟酰胺基团的化合物称为还原型硫代辅酶I；用3-乙酰吡啶基团取代烟酰胺基团的化合物称为还原型3-乙酰吡啶辅酶I。结构式分别如下A还原型辅酶I B还原型硫代辅酶I C还原型3-乙酰吡啶辅酶I 还原型辅酶I衍生物来源于氧化型辅酶I衍生物，将氧化型辅酶I衍生物还原，可得到还原型辅酶I衍生物。普通的化学方法是采用硫代硫酸钠作为还原剂，但会产生许多异构体影响产品质量，原料不可作为诊断试剂原料，如果进一步分离纯化，将大大增加产品成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶转化法制备还原型辅酶I衍生物的方法。它是将0.1-50mM MgCl2、5-200mM pH为6.5-8.5的磷酸盐缓冲液、0.1-5％氧化型辅酶I衍生物、0.03-2％L-苹果酸或苹果酸盐、100-5000U苹果酸脱氢酶进行酶催化反应，反应温度为25-45℃，减压，于还原型辅酶I衍生物的最大吸收峰处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至8.5-10.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为35-55℃，在浓缩液中加入7-13倍浓缩液体积的乙醇，2-8℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤2-4次脱水，真空干燥即可。所述的还原型辅酶I衍生物为还原型硫代辅酶I或还原型3-乙酰吡啶辅酶I。苹果酸脱氢酶为EC1.1.1.38、EC1.1.1.39或EC1.1.1.40。苹果酸为L-苹果酸或D，L-苹果酸。苹果酸盐为L-苹果酸盐或D，L-苹果酸盐。本专利技术中的辅酶I及其衍生物原料在中性反应条件下性质较为稳定，反应时间可以大大延长。时间延长可以降低酶和苹果酸盐的用量，使分离纯化工艺简化；同时辅酶I及其衍生物在反应时的分解也会降低，使产品质量提高。具体实施例方式本方法采用苹果酸脱氢酶转化生成还原型辅酶I衍生物，反应在中性条件下进行。反应中生成的CO2通过减压抽出，使反应转为单向反应。氧化型辅酶I衍生物全部转化为还原型辅酶I衍生物，转化效率高，终产品质量好。反应所采用的反应式为 反应的pH为6.5-8.5左右，在此条件下，氧化型辅酶I及其衍生物性质较为稳定，反应时间可以大大延长。时间延长可以降低酶和苹果酸盐的用量，使分离纯化工艺简化；同时辅酶I衍生物在反应时的分解也会降低，使产品质量提高。反应所采用的酶为苹果酸脱氢酶，包括EC1.1.1.38、EC1.1.1.39、EC1.1.1.40等。酶来源于微生物和动物组织中(如大肠杆菌中和鸽子的肝中)。采用基因工程的方法将酶的基因片段克隆，可以大量表达酶。酶的纯度也显著提高，反应简化，终产品质量提高。本专利技术采用的酶均直接从试剂公司购买(如SIGMA公司等)。反应的其它原料，如辅酶I衍生物要求纯度在90％以上，苹果酸和苹果酸盐的纯度在98％以上。实施例1制备还原型硫代辅酶I反应在避光条件下进行，5mM MgCl2、50mM pH为7.5的磷酸盐缓冲液、1.3％氧化型硫代辅酶I、0.3％L-苹果酸、1000U苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.40)进行酶催化反应，反应温度为37℃，减压，于398nm测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至9.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为42℃，在浓缩液中加入9倍浓缩液体积的乙醇，4℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤2次脱水，真空干燥得成品还原型硫代辅酶I，纯度在90％以上。实施例2制备还原型3-乙酰吡啶辅酶I0.1mM MgCl2、5mM pH为6.5的磷酸盐缓冲液、0.1％氧化型3-乙酰吡啶辅酶I、0.03％L-苹果酸钠、100U苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.38)进行酶催化反应，反应温度为25℃，减压，于363nm处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至8.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为35℃，在浓缩液中加入7倍浓缩液体积的乙醇，2℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤2次脱水，真空干燥得成品还原型3-乙酰吡啶辅酶I，纯度在90％以上。实施3制备还原型硫代辅酶I反应在避光条件下进行，50mM MgCl2、200mM pH为8.5的磷酸盐缓冲液、5％氧化型硫代辅酶I、2％D，L-苹果酸、5000U苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.39)进行酶催化反应，反应温度为45℃，减压，于398nm测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至10.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为55℃，在浓缩液中加入13倍浓缩液体积的乙醇，8℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤4次脱水，真空干燥即可。实施例4制备还原型3-乙酰吡啶辅酶I5mM MgCl2、50mM pH为7.5的磷酸盐缓冲液、1.3％氧化型3-乙酰吡啶辅酶I、1.7％DL-苹果酸钠、2000U苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.39)进行酶催化反应，反应温度为37℃，减压，于363nm测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至9.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为42℃，在浓缩液中加入9倍浓缩液体积的乙醇，6℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤3次脱水，真空干燥得成品还原型3-乙酰吡啶辅酶I，纯度在90％以上。权利要求1.一种酶转化法制备还原型辅酶I衍生物的方法，其特征在于1-20mMMgCl2、10-200mM pH为6.5-8.5的磷酸盐缓冲液、0.1-5％辅酶I衍生物、0.03-2％L-苹果酸或苹果酸盐、100-5000U苹果酸脱氢酶进行酶催化反应，反应温度为25-45℃，减压，于还原型辅酶I衍生物的最大吸收峰处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节pH至8.5-10.5，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为35-55℃，在浓缩液中加入7-13倍浓缩液体积的乙醇，2-8℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤2-4次脱水，真空干燥即可。2.根据权利要求1所述的一种酶转化法制备还原型辅酶I衍生物的方法，其特征在于，所述的还原型辅酶I衍生物为还原型硫代辅酶I或还原型3-乙酰吡啶辅酶I。3.根据权利要求1所述的一种酶转化法制备还原型辅酶I衍生物的方法，其特征在于，所述的苹果酸脱氢酶为EC1.1.1.38、EC1.1.1.39或EC1.1.1.40。4.根据权利要求1所述的一种酶转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶转化法制备还原型辅酶Ｉ衍生物的方法，其特征在于：１－２０ｍＭＭｇＣｌ↓［２］、１０－２００ｍＭｐＨ为６．５－８．５的磷酸盐缓冲液、０．１－５％辅酶Ｉ衍生物、０．０３－２％Ｌ－苹果酸或苹果酸盐、１００－５０００Ｕ苹果酸脱氢酶进行酶催化反应，反应温度为２５－４５℃，减压，于还原型辅酶Ｉ衍生物的最大吸收峰处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节ｐＨ至８．５－１０．５，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，浓缩温度为３５－５５℃，在浓缩液中加入７－１３倍浓缩液体积的乙醇，２－８℃静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤２－４次脱水，真空干燥即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永良，闻树群，
申请(专利权)人：杭州利安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]