酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法及其应用。利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，苹果酸产量提高了30％。

Enzymatic process for the synthesis of nicotinamide cytosine dinucleotide

The present invention relates to a method for enzymatic synthesis of nicotinamide cytosine dinucleotide and its application. Nicotinamide nicotinamide cytosine dinucleotide was prepared by using nicotinamide mononucleotide transferase mutant as a catalyst to catalyze the coupling reaction between nicotinamide mononucleotide and cytosine nucleoside three. The gene encoding nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase mutants expressed in microbial cells, engineered bacteria using endogenous metabolites and intracellular nicotinamide cytosine dinucleotide, nicotinamide dinucleotide cytosine as a coenzyme mediated selective redox reaction, improve the yield of the secondary metabolites. In a typical example, malic acid production has increased by 30%.

【技术实现步骤摘要】
酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamidecytosinedinucleotide，NCD)的方法及其应用，在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成NCD，并且胞内NCD可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。
技术介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态(NADH)在细胞繁殖，生长，分化，凋亡等生命活动中都起着非常重要的作用(W.Ying,etal.Antioxidants&RedoxSignaling.2008,10,179)。此外，NAD(H)还是许多重要氧化还原酶的辅酶，起传递氢和电子的作用。由于生物体内NAD(H)同时参与多种反应，因此在大部分目标产物的生物代谢网络中，都会存在一步或多步利用NAD(H)的反应。现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢网络进行调控。常见的策略有，1)改变胞内辅酶合成，降解，回补代谢和不同辅酶分子相互转化的能力，2)改变氧化还原酶的辅酶偏好性，3)在细胞内表达可再生辅酶的酶，如葡萄糖脱氢酶等，并在培养环境中额外添加相应酶的底物。但是，由于NAD(H)是一种通用的辅酶，胞内NAD(H)水平及不同氧化态的扰动往往会对细胞生理及代谢等产生难以预测的全局性影响。因此，为了实现特异性调控目标代谢网络，亟需一种方法使目标代谢网络从复杂代谢网络中独立出来，即需要重新设计出一个生物正交系统(K.Shokat,etal.DrugDiscoveryToday.2002,7,872)。在依赖于NAD类似物的生物正交系统中，NAD(H)类似物可以在该正交代谢途径中传递，而不影响其他利用NAD(H)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(H)也不会影响到生物正交代谢途径。因此，仅靠调控NAD(H)类似物的含量就可以对生物正交系统进行特异性的代谢调控，从而达到提高目标途径产量的目的。由于依赖于NAD(H)的氧化还原酶与其辅酶的主要结合作用发生在腺嘌呤结合域，吡啶环部分主要起传递电子的作用，因此，为了保证NAD类似物的氧化还原性能，只能对NAD的腺嘌呤环部分进行改造。目前，大多数NAD类似物均采用化学法合成。但是，化学法合成NAD类似物通常面临步骤繁琐，化学性质不稳定，分离，纯化较困难，且成本较高，不能直接应用于生物体等问题。因此，有人采用酶促方法合成NAD类似物(H.迪费尔，D.海因德尔，C.迈尔，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申请号：201080033434.1)。其借助野生型烟酰胺核糖激酶(RNK)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)进行NAD类似物的酶促反应合成。其中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamide/nicotinicacidmononucleotideadenylyltransferase，NMNAT)根据物种来源不同，分别可由基因nadD，nadM，nadR表达，蛋白产物为NadD，NadR，NadM，其可将烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)或烟酸单核苷酸(nicotinicacidmononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)进行缩合反应合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途径中的关键酶。虽然在体外反应条件下，野生NMNAT也可表现出很低的合成少数NAD类似物的活性(M.Emanuelli,etal.ProteinExpressionandPurification.2003,27,357)，但不足以用于制备或进行胞内直接合成NAD类似物。烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamidecytosinedinucleotide，NCD)是一种NAD类似物，可作为辅酶介导氧化还原反应。通过构建依赖NCD的氧化还原酶，可以建立生物正交的氧化还原体系，用于控制细胞内代谢过程(D.Ji,etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011,133,20857)。虽然通过化学方法可以合成NCD，但NCD和NAD一样，不能自由透过细胞膜，成为胞内应用NCD的瓶颈。因此，需要建立一种酶促合成NCD的方法，以利用细胞内源代谢物直接在胞内合成NCD。
技术实现思路
针对化学法合成NCD步骤繁琐，分离纯化困难，NCD难以进入细胞等缺点，并且目前尚未发现可高效催化合成NCD的酶，本专利技术的目的是提供一种酶促合成NCD的方法，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，催化合成NCD，并且通过在胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，实现直接在胞内合成NCD，应用于选择性调控代谢过程和提高目标代谢产物产量。一方面，本专利技术提供了一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)的方法，以烟酰胺单核苷酸(NMN)和胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中的一种或二种以上，其中，SEQIDNO:1是来源于大肠杆菌的NadD的氨基酸序列，SEQIDNO:2是来源于大肠杆菌的NadR的氨基酸序列，SEQIDNO:3是来源于土拉热弗朗西丝氏菌的NadM的氨基酸序列。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个以上氨基酸进行突变获得的突变体，突变位点为下述序列中氨基酸位点中的一种或二种以上：一种在SEQIDNO:1的氨基酸序列中的突变位点为：22位突变为S，L，A或G中的一种，26位突变为M，V，F或R中的一种，45位突变为W，Y或L中的一种，82位突变为K，E，L或T中的一种，84位突变为K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一种，85位突变为R，M，Q，Y，L，S，W，G或A中的一种，86位突变为R，F，D，K，S或W中的一种，105位突变为M或L中的一种，107位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，118位突变为D，H，T，P，G，N，A或R中的一种，132位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，174位突变为I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一种，175位突变为T，M，K，S，N，M，W，E或G中的一种，176位突变为M，G，S，A，P，T，R或K中的一种，179位突变为R，K，V，S，N，R，G，T或N中的一种，132，133位插入突变为三个氨基酸a，b，c，其中a为L，V，F，P，E，R，G或A中的一种，b为Q，P，A，N，L，E，S，C或H中的一种，c为R，L，V，G，M，F，A或T中的一种，174，175，176位缺失突变为两个氨基酸d，e，其中d为A，S，T或P中的一种，e为S，P，G或A中的一种，或177，178，179位缺失突变为两个氨基酸f，g，其中f为A，E，L，P，R或S中的一种，g为P，I，K，V，S，N，R，G或T中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；或，一种在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的突变位点为：83位突变为R，K，V或M中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸；所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种或二种以上，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个以上氨基酸进行突变获得的突变体，突变位点为下述序列中氨基酸位点中的一种或二种以上：一种在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的突变位点为：22位突变为S，L，A或G中的一种，26位突变为M，V，F或R中的一种，45位突变为W，Y或L中的一种，82位突变为K，E，L或T中的一种，84位突变为K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一种，85位突变为R，M，Q，Y，L，S，W，G或A中的一种，86位突变为R，F，D，K，S或W中的一种，105位突变为M或L中的一种，107位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，118位突变为D，H，T，P，G，N，A或R中的一种，132位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，174位突变为I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一种，175位突变为T，M，K，S，N，M，W，E或G中的一种，176位突变为M，G，S，A，P，T，R或K中的一种，179位突变为R，K，V，S，N，R，G，T或N中的一种，132，133位插入突变为三个氨基酸a，b，c，其中a为L，V，F，P，E，R，G或A中的一种，b为Q，P，A，N，L，E，S，C或H中的一种，c为R，L，V，G，M，F，A或T中的一种，174，175，176位缺失突变为两个氨基酸d，e，其中d为A，S，T或P中的一种，e为S，P，G或A中的一种，或177，178，179位缺失突变为两个氨基酸f，g，其中f为A，E，L，P，R或S中的一种，g为P，I，K，V，S，N，R，G或T中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；或，一种在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的突变位点为：83位突变为R，K，V或M中的一种，87位突变为Q，G或L中的一种，148位突变为N，Q，H或S中的一种，154位突变为H，Y或F中的一种，177位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，178位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，179位突变为F，V，R，L，S，G，A，W或P中的一种，206位突变为F，L，V，Y或S中的一种，207位突变为Q，H，E，Q或D中的一种，198，199，200位缺失突变为两个氨基酸a，b，其中a为A，G，L，S或T中的一种，b为Y，P，T，F，N或Q中的一种，或202，203，204位缺失突变为两个氨基酸c，d，其中c为L，M，F，L或V中的一种，d为A，E，D，N，V或I中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；或，一种在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的突变位点为：20位突变为R，K，V，T，M或L中的一种，21位突变为M，S，K，T，L，F，G，W，Q或R中的一种，23位突变为R，T，L或Q中的一种，24位突变为N，W，K，S，F，R，G，V，T，D，P，E或A中的一种，109位突变为N，Q，F，Y，C，T或S中的一种，110位突变为R，L，N或Q中的一种，112位突变为R，Q，E，F或Y中的一种，130位突变为P，G，A或S中的一种，131位突变为A，G，R，F，S，L，E，V，C，W，I或P中的一种，132位突变为R，W，V，A，S或G中的一种，133位突变为V，T，Q，L或E中的一种，134位突变为P，E，A或G中的一种，135位突变为T，G，S，K或R中的一种，或136位突变为I，L或V中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质。...

【技术特征摘要】
1.一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸；所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中的一种或二种以上，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个以上氨基酸进行突变获得的突变体，突变位点为下述序列中氨基酸位点中的一种或二种以上：一种在SEQIDNO:1的氨基酸序列中的突变位点为：22位突变为S，L，A或G中的一种，26位突变为M，V，F或R中的一种，45位突变为W，Y或L中的一种，82位突变为K，E，L或T中的一种，84位突变为K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一种，85位突变为R，M，Q，Y，L，S，W，G或A中的一种，86位突变为R，F，D，K，S或W中的一种，105位突变为M或L中的一种，107位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，118位突变为D，H，T，P，G，N，A或R中的一种，132位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，174位突变为I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一种，175位突变为T，M，K，S，N，M，W，E或G中的一种，176位突变为M，G，S，A，P，T，R或K中的一种，179位突变为R，K，V，S，N，R，G，T或N中的一种，132，133位插入突变为三个氨基酸a，b，c，其中a为L，V，F，P，E，R，G或A中的一种，b为Q，P，A，N，L，E，S，C或H中的一种，c为R，L，V，G，M，F，A或T中的一种，174，175，176位缺失突变为两个氨基酸d，e，其中d为A，S，T或P中的一种，e为S，P，G或A中的一种，或177，178，179位缺失突变为两个氨基酸f，g，其中f为A，E，L，P，R或S中的一种，g为P，I，K，V，S，N，R，G或T中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；或，一种在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的突变位点为：83位突变为R，K，V或M中的一种，87位突变为Q，G或L中的一种，148位突变为N，Q，H或S中的一种，154位突变为H，Y或F中的一种，177位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，178位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，179位突变为F，V，R，L，S，G，A，W或P中的一种，206位突变为F，L，V，Y或S中的一种，207位突变为Q，H，E，Q或D中的一种，198，199，200位缺失突变为两个氨基酸a，b，其中a为A，G，L，S或T中的一种，b为Y，P，T，F，N或Q中的一种，或202，203，204位缺失突变为两个氨基酸c，d，其中c为L，M，F，L或...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，王雪颖，刘玉雪，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21