用于ALDH2基因芯片检测的特异性引物对和探针制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了用于检测ALDH2基因的SNP位点的特异性寡核苷酸探针，这种探针可以与ALDH2基因第504位不同基因型杂交。本发明专利技术还公开了检测上述SNP位点时，用于扩增ALDH2基因的特异性引物对，引物对可特异性扩增ALDH2基因中的含有检测目标位点的目标区域。本发明专利技术所提供的产品可用于检测ALDH2基因型，为人们了解自身的个体酒精代谢解毒能力、正确使用硝酸甘油提供信息。

Specific primer pairs and probes for ALDH2 microarray detection

The present invention relates to the field of molecular biology, and discloses a specific oligonucleotide probe for detecting the SNP locus of the ALDH2 gene, which can be hybridized with 504th different genotypes of the ALDH2 gene. The invention also discloses a detection of the SNP locus, for specific primers on the amplification of ALDH2 gene, primers to specifically amplify ALDH2 gene contains target detection of the target site. The products provided by the invention can be used for detecting the ALDH2 genotype and providing information for people to understand their own individual alcohol metabolism, the ability to detoxify, and the correct use of nitroglycerin.

【技术实现步骤摘要】
用于ALDH2基因芯片检测的特异性引物对和探针
本专利技术涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体设计用于扩增ALDH2基因的特异性引物对和用于ALDH2基因芯片检测的特异性探针。
技术介绍
人类乙醒脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。ALDH2基因第12外显子内存在一个单核苷酸多态(singlenucleotide polymorphism, SNP)-rs671,出现碱基置换:鸟嘌呤(G)—腺嘌呤(A),故导致密码子改变:GAA — AAA，进而发生该酶第504个氨基酸的改变，谷氨酸(Glu)—赖氨酸(Lys) ο ALDH2 有两个等位基因:野生型(ALDH2*1, *504Glu)，突变型(ALDH2*2, *504Lys)。研究证实，ALDH2这一突变导致酶活性发生显著改变，会严重影响酒精、硝酸甘油等的代谢，且这一突变存在明显的种族差异，其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚黄种人中突变率高达30%-50%。检测ALDH2的基因型，对揭示个体酒精代谢解毒能力以及正确使用硝酸甘油，具有重要意义。目前测定 ALDH2基因型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，难以满足临床检验的要求。近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一便是基因芯片。用基因芯片检测ALDH2基因亚型，发挥基因芯片检测操作简单、快捷、结果准确的特点。【专利技术内容】本专利技术的目的在于提供一种用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性扩增弓丨物对和特异性寡核苷酸杂交探针。这种用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性寡核氨酸探针可以与ALDH2基因第504位不同基因型杂交，用于检测ALDH2基因rs671的504Glu/LysSNP位点。特异性寡核氨酸探针序列如下，使用时可从下列三条序列中挑选一条:检测位点为504Glu(GAA)时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一(下划线部分为SNP位点):(I)SEQ ID N0.1:5’-CAGGCATACACT￡AAGTGAAAA_3’ ；(2) SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACI^AAGTGAAAACTG-3’ ；(3) SEQ ID N0.3:5’ -AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ；所述的检测位点为504Lys (AAA)时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一(下划线部分为SNP位点):(4) SEQ ID N0.4:5’ -GCAGGCATACACTMAGTGAAAACT-3’(5) SEQ ID N0.5:5’ -GGCATACACTMAGTGAAAACTG-3’(6) SEQ ID N0.6:5’ -CTGCAGGCATACACTMAGTGAA-3’优选的，所述的检测位点为504Glu (GAA)时，特异性寡核苷酸探针为SEQIDN0.1-3中的一个；所述的检测位点为504Lys (AAA)时，特异性寡核苷酸探针为SEQ IDN0.4-6中的一个。更优选的，所述的检测位点为504Glu (GAA)时，特异性寡核苷酸探针为SEQIDN0.1-3中的一个，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸；所述的检测位点为504Lys (AAA)时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID N0.4_6中的一个，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸。聚脱氧胸苷酸长度为5~25。即上述特异性寡核苷酸探针的5’端还包含一段5-25聚的聚脱氧胸苷酸。检测上述ALDH2基因SNP位点时，用于扩增ALDH2基因rs671的504Glu/Lys SNP位点所使用的特异性引物对含有以下核苷酸序列之一: (I)上游 SEQ ID N0.7:5，-AAGACTTTGGGGCAATACAG-3’下游 SEQ ID N0.8:5，-GGGTAAAATTCGGACTCTTC-3，，或，(2)上游 SEQ ID N0.9:5’ -GGGGGTCCTGGGAGTGTAAC-3’下游 SEQ ID N0.10:5，-CCTAAATCCCAGACGACCCG-3，，或，(3)上游 SEQ ID N0.11:5’ -AGTGTAACCCATAACCCCCA-3’下游 SEQ ID N0.12:5-CATTTCTGGGTCGGAGACGA_3，。即引物对序列含有SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者含有SEQ IDN0.9和N0.10的核苷酸序列，或者含有SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。优选的，所述引物对序列为SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者SEQID N0.9和N0.10的核苷酸序列，或者SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。更优选的，上述特异性引物对核苷酸序列的5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。利用上述引物对及特异性寡核苷酸探针检测ALDH2基因rs671的504Glu/Lys位点的方法，步骤包括:(I)制备待测样品的基因组DNA ；(2)采用聚合酶链反应方法扩增ALDH2基因中包含504Glu/Lys SNP位点的基因片段；用上述的引物对进行扩增，(3)将所得扩增产物与杂交缓冲液混合；(4)将上述混合液与ALDH2基因SNP检测芯片杂交；所述的ALDH2基因SNP检测芯片包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异性寡核苷酸探针；(5)检测芯片的杂交信号。步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应，或者荧光检测。上述的特异性寡核苷酸探针用于制备ALDH2基因SNP检测芯片或试剂盒。上述的引物对用于制备ALDH2基因SNP检测芯片或试剂盒。本专利技术还提供一种用于检测ALDH2基因SNP的试剂盒，该试剂盒包含上述的ALDH2基因SNP检测芯片和使用说明书。上述ALDH2基因SNP检测芯片可用于检测ALDH2基因504Glu/Lys SNP位点的基因型。上述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;Derisi，JL等于1997年在《科学》278 (5338):680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(Dersi，几，IyerVR, Brown P0.Exploring the metablic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science.1997; 278 (5338):680-686)及马立人等主编的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针用于检测ALDH2基因rs671的504Glu/Lys?SNP位点；所述的检测位点为504Glu时，特异性寡核苷酸探针序列为含有以下核苷酸序列之一：（1）SEQ?ID?No.1：5“?CAGGCATACACTGAAGTGAAAA?3“；（2）SEQ?ID?No.2：5“?GGCATACACTGAAGTGAAAACTG?3“；（3）SEQ?ID?No.3：5“?AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT?3；所述的检测位点为504Lys时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：（4）SEQ?ID?No.4：5“?GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT?3“（5）SEQ?ID?No.5：5“?GGCATACACTAAAGTGAAAACTG?3“（6）SEQ?ID?No.6：5“?CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA?3“。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针用于检测ALDH2基因rs671的504Glu/Lys SNP位点； 所述的检测位点为504Glu时，特异性寡核苷酸探针序列为含有以下核苷酸序列之一:(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ； (3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； 所述的检测位点为504Lys时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一:(4)SEQ ID N0.4:5’-GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT-3’(5)SEQ ID N0.5:5’-GGCATACACTAAAGTGAAAACTG-3’(6)SEQ ID N0.6:5’-CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA-3’。2.权利要求1所述用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于， 所述的检测位点为504Glu时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一:(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ；(3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； 所述的检测位点为504Lys时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一:(4)SEQ ID N0.4:5’-GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT-3’(5)SEQ ID N0.5:5’-GGCATACACTAAAGTGAAAACTG-3’(6)SEQ ID N0.6:5’-CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA-3’。3.权利要求1所述用于检测ALDH2基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所述的检测位点为504Glu时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5~25:(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ；(3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢军芬，朱滨，孙悦，张宇，张莹，
申请(专利权)人：上海百傲科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：