一种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法技术

本发明专利技术建立了一种从复杂的核酸文库中快速获得具有某种特性分子的方法。首先通过乳浊液核酸扩增技术，将文库的单个分子分别扩增到单个微珠A上，使得每个微珠A上只有一种特定序列的核酸分子。再在另一种不同性质的微珠B(如磁珠)上偶联靶标分子，将两种微珠混合在一起使其结合，然后洗去未结合的微珠A，分离带有靶分子的微珠B，此时与靶分子结合的微珠A会一并得以分离，与微珠B上的靶分子特异性结合的每个微珠A上的核酸分子即为所需的单一序列核酸分子。此方法快捷方便，无需经过克隆和测序即可得到高亲和力的单一核酸分子。该技术可以广泛用于启动子的筛选和核酸适配体的筛选与鉴定中。

Method for rapid identification and separation of affinity nucleic acid molecules

The present invention establishes a method for rapidly obtaining a characteristic molecule from a complex nucleic acid library. The emulsion of nucleic acid amplification techniques, single molecule libraries were amplified by single bead A, so that each bead A only a specific sequence of nucleic acid molecules. In another B beads with different properties (such as bead) on the coupling of two kinds of target molecules, beads mixed together to make the combination of bead A and then wash away the unbound beads, B separation with target molecules, A beads at this time and the target molecules will be separated. Nucleic acid molecules on the A beads with each micro molecular target specific B binding beads is required for a single sequence of nucleic acid molecules. This method is quick and convenient, and can obtain high affinity single nucleic acid molecule without cloning and sequencing. This technique can be widely used in the screening of promoters and screening and identification of aptamers.

【技术实现步骤摘要】
—种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法
本专利技术涉及一种鉴定分离方法，特别是从一个混合的核酸分子库中快速鉴定和分离出具有某种特性分子的方法。
技术介绍
核酸分子包括DNA和RNA，在生命体中扮演着极为重要的角色。其中一部分核酸分子能够与其它分子相互作用，通过这种相互作用来传递信息并发挥特定的功能。这种能够与其它分子相互作用的核酸分子不仅在生命体中普遍存在，还可以通过体外筛选的方法，从而获得具有特定功能的核酸分子。这种体外筛选技术被称作SELEX(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术，于 1990 年由美国的三个实验室独立专利技术。不管是寻找生物体内具有特定功能的核酸分子，或是体外通过SELEX技术获得具有特定功能的核酸分子，都是一项极其复杂、耗时费力的工作。常规的方法是先合成随机的文库分子，将靶分子与文库分子在一定条件下混合，通过某种分离方法将未与靶分子结合的部分洗掉，留下与靶分子结合的分子。由于分离技术的效率、污染、非特异结合、PCR的非特异扩增等原因，这种步骤往往需要重复很多轮才能得到与靶分子结合的富集文库分子。这些文库依然是一个多分子的复杂混合物。从富集的文库中鉴定出高亲和力的单个序列是整个过程的限速步骤。目前主要有以下几种方法:一是将富集后的文库序列构建克隆，转化大肠杆菌，然后挑取单个菌落，提取核酸并测序；通常要测试多个序列，然后比较分析得出可能性高的序列信息，进行化学合成，然后再进行亲和力验证。这是最普遍采用的方法。近年来由于高通量测序技术的进步，兴起的另一种方法是将文库分子全部进行测序，然后比较不同序列的丰度，通过生物信息学方法进行分析，得出优选的序列，再进行合成和验证。这种方法，成本高昂，而且需要高通量的测序仪器，只有少数实验室能够采用这种方法；这种方法虽然无需经过克隆，但只能获得序列信息，仍需要通过合成和亲和力验证，才能得到特定的分子。而且，由于不均等扩增，不同序列扩增效率不同等原因，导致高丰度的序列未必是高亲和力的序列。所以，以上现有方法都无法快速直接获得高亲和力的单一序列核酸分子。本专利技术建立了一种快速鉴定和分离特定核酸分子的方法，可以在不经过测序的条件下，直接获得具有高亲和力的单一序列核酸分子。
技术实现思路
本专利技术首先将经过富集的核酸分子库，利用乳浊液核酸扩增(PCR)技术将复杂核酸分子库中的单个核酸分子在一种微珠A表面实现放大扩增，确保每个微珠A上只有一种序列；然后将获得的微珠A与偶联有靶分子的另一种微珠B混合，经过充分的混匀与结合后，将未结合的微珠A洗去,最后收集微珠B,部分含有特殊序列分子的微珠A,由于与微珠B表面偶联的靶分子结合，而被保留下来，这些微珠A上的特定核酸分子即为所需的单一序列分子。上面中所述分离方法可以是磁力分离、重力分离或浮力分离中的一种；上面中所述微珠A如果不是磁性微珠，B可以是磁性微珠，并利用磁性来分离微珠B ；上面中所述微珠A如果密度小于水，B则可以使用密度大于水的微珠；反之亦然；如果需要鉴定双链DNA分子与靶分子的结合，则PCR扩增完后无需解离双链；如果需要鉴定单链的DNA分子与靶标结合，则需要将微珠A上的扩增产物解离成单链分子，解离方法可以通过加热解离，也可以通过碱解离；如果需要鉴定RNA分子与靶标的结合情况，首先要将RNA反转录成DNA分子，通过乳浊液PCR将DNA分子分散成单克隆，扩增到微珠A上；然后用液滴包裹微珠A并在液滴中完成RNA分子的转录过程；由于微珠A上偶联有与RNA配对的引物，通过加热变性可以将RNA通过与引物的杂交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再将微珠A与偶联有靶分子的微珠B进行孵育结合；按照选自磁力分离、重力分离或浮力分离的方法分离复合微珠A-B，所得A微珠上的RNA即为与靶分子结合的单克隆RNA分子。本专利技术的方法既是一种快速鉴定技术，也是一种快速筛选技术。将一定库容的随机文库分子扩增到微珠上，解离成单链，用靶标分子结合，分离出与靶标分子结合的微珠，即相当于从原始的文库中筛选出所需的分子。本专利技术中微珠的挑取方法，可以采用显微操作法，也可以利用分选流式进行筛选。如果靶分子是细胞表面的膜蛋白，微珠B可以直接用细胞代替。综上所述，本专利技术提供下述各项实施方案:1.一种快速鉴定和分离核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤:(I)将待鉴定和分离的核酸分子的特异性引物之一偶联到微珠A上，然后通过乳浊液PCR的方法，将文库分子分散成单模板并且扩增到微珠A上；(2)将扩增有单模板的微珠A与另一种偶联有祀分子的微珠B混合,并移除未与微珠B结合的微珠A，回收微珠B，得到与微珠B上的靶分子特异性结合的微珠A，与微珠B上的靶分子特异性结合的每个微珠A上即结合有待鉴定和分离的单克隆的核酸分子。2.第I项所述的方法， 其中步骤(1)中引物与微珠A表面的偶联为共价偶联或非共价偶联。3.第I项所述的方法，其中步骤(1)中的引物预先用氨基修饰或用生物素修饰。4.第I项所述的方法，其中步骤(2)中分离微珠A和A-B复合微珠的方法是磁力分离、重力分离或浮力分离中的任一种。5.第I项所述的方法，其中微珠A为非磁性微珠，微珠B为磁性微珠，并利用磁力来分离微珠A与A-B复合物。6.第I项所述的方法，其中微珠A的密度小于水，微珠B的密度大于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍大于水，利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，离心沉淀物中即包含A-B复合物。7.第I项所述的方法，其中微珠A的密度大于水，微珠B的密度小于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍小于水，并利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，上清表面即包含A-B复合物。8.第I项所述的方法，其中鉴定双链DNA分子与靶分子的结合时，PCR扩增完后无需解离双链；当鉴定单链DNA分子与靶分子结合时，需要将微珠A上的扩增产物解离成单链DNA分子。9.第I项所述的方法，当鉴定RNA分子与靶分子的结合情况时，所述方法包括下述步骤:(1)在微珠A上偶联用于扩增DNA模板的引物序列和用于捕获RNA分子的配对序列，其中用于捕获RNA分子的配对序列末端进行封闭修饰，使其无法用于延伸扩增；(2)将RNA分子反转录成DNA分子，通过乳浊液PCR将所述DNA分子分散成单克隆，扩增到步骤(1)得到的微珠A上；(3)用液滴包裹步骤(2)得到的微珠A并在液滴中完成RNA分子的转录过程；由于所述微珠A上偶联有用于捕获RNA分子的配对序列，通过加热变性可以将RNA通过与配对序列的杂交而固定到微珠A上；回收微珠A，然后再将微珠A与偶联有靶分子的微珠B进行孵育结合；分离复合微珠A-B，即可获得与靶分子结合的单克隆RNA分子。10.第I一9项中任一项所述的方法，所述方法还包括对分离的单克隆分子进行测序的步骤。本专利技术的方法将分子间结合转变成了两个珠子之间的结合，从而将不可直接操作的分子变成可以直接操作的微珠。因此，与现有鉴定技术相比，本专利技术的方法具有多方面的优势:1.相比于现有技术，无需经过测序等步骤，可以快速获得高亲和力的单一序列核酸分子；2.本专利技术的方法既可以作为单克隆鉴定的方法，也是一种筛选方法；直接可以获得高亲和力的单克隆，无需合成多种序列后再进行测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定和分离核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤：(1)将待鉴定和分离的核酸分子的特异性引物之一偶联到微珠A上，然后通过乳浊液PCR的方法，将文库分子分散成单模板并且扩增到微珠A上；(2)将扩增有单模板的微珠A与另一种偶联有靶分子的微珠B混合，并移除未与微珠B结合的微珠A，回收微珠B，得到与微珠B上的靶分子特异性结合的微珠A，与微珠B上的靶分子特异性结合的每个微珠A上即结合有待鉴定和分离的单克隆的核酸分子。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定和分离核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤: (1)将待鉴定和分离的核酸分子的特异性引物之一偶联到微珠A上，然后通过乳浊液PCR的方法，将文库分子分散成单模板并且扩增到微珠A上； (2)将扩增有单模板的微珠A与另一种偶联有祀分子的微珠B混合,并移除未与微珠B结合的微珠A，回收微珠B，得到与微珠B上的靶分子特异性结合的微珠A，与微珠B上的靶分子特异性结合的每 个微珠A上即结合有待鉴定和分离的单克隆的核酸分子。2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中引物与微珠A表面的偶联为共价偶联或非共价偶联。3.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的引物预先用氨基修饰或用生物素修饰。4.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中分离微珠A和A-B复合微珠的方法是磁力分离、重力分离或浮力分离中的任一种。5.权利要求1所述的方法，其中微珠A为非磁性微珠,微珠B为磁性微珠,并利用磁力来分离微珠A与A-B复合物。6.权利要求1所述的方法，其中微珠A的密度小于水，微珠B的密度大于水，并且微珠B与微球A结合后的整体密度仍大于水，利用离心方法来分离微珠A与A-B复合物，离心沉淀物中即包含A-B复合物。7.权利要求1所述的方法，其中微珠A的密度大于水，微珠B的密...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，罗炎，欧惠超，周宏敏，张海燕，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：