一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，试剂盒包括含有SEQ?ID?NO.1所示的正向扩增引物、SEQ?ID?NO.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示的测序引物1和测序引物2。采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者血液DNA中线粒体基因突变。本发明专利技术的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简单，反应时间短，高通量，比传统的毛细管电泳测序灵敏度高，更适合于突变的分析。

Kit for detecting 1555 - bit A-G and 1494 - C-T mutations in mitochondrial genes

Kit for 1555 A-G and 1494 C-T mutation in a mitochondrial gene detection provided by the invention comprises a kit containing SEQ? ID? SEQ positive amplification primers, shown in the NO.1? ID? NO.2 shows the reverse primer amplification reaction PCR, SEQ? ID? NO.3 and SEQ? ID sequencing primer? NO.4 shows 1 and 2 sequencing primers. PCR combined with pyrosequencing technique was used to detect mitochondrial gene mutations in DNA of patients' blood. The kit of the invention can be real-time monitoring the reaction process, short reaction time, simple processing can be the product of PCR phosphoric acid sequencing, simple operation, short reaction time, high throughput, compared with the traditional high sensitivity of capillary electrophoresis sequencing, more suitable for mutation analysis.

【技术实现步骤摘要】
—种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒
本专利技术涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者血液DNA中线粒体基因突变，具体涉及检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒。
技术介绍
线粒体12SrRNA基因是氨基糖苷类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。由于A1555G和C1494T突变在12SrRNA基因形成G-C和U-A配对使得与氨基糖苷类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。因此对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。目前关于线粒体耳聋基因的检测方法有多种，文献已报道的方法有:酶切法、直接测序法、基因芯片法、实时荧光定量Taqman探针法等。检测的突变热点主要是1555、1494、961等。目前这些方法只能定性检测是否有基因突变，而且只能检测出突变细胞比率在10%-20%以上的外周血，相比于 传统测序等方法，焦磷酸测序灵敏度更高，成本更低，不仅可以定性检测是否有基因突变，而且可以获得突变的比例。焦磷酸测序技术是一种基于聚合原理的DNA测序方法，是新一代DNA序列分析技术。它是有4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。目前市场上还没有利用焦磷酸测序技术进行线粒体基因突变检测的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，是具有特异性高、成本低、定量、准确检测线粒体基因突变的试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒包括含有SEQ ID N0.1所示的正向扩增引物、SEQ ID N0.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ ID N0.3、SEQID N0.4所示的测序引物I和测序引物2。正向扩增引物SEQ ID N0.1:5’ -GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’ (mtDNAntl463-1482)。反向扩增引物SEQ ID N0.2:5’ -biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ (mtDNAntl673-1692)。测序引物I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，(mtDNA ntl464_1483)。测序引物2SEQ ID N0.4:5，-TACGCATTTATATAGAGGAG-3’ (mtDNA ntl535_1554)。所述试剂盒中含有空白对照品，所述空白对照品为水。试剂盒含有A1555G与C1494T突变的阳性对照品。测序引物I的序列与正向扩增引物SEQ ID N0.1相同。所述的PCR反应液中其他组分为常规的10 X PCR Buffer、dNTPs和H2O,各组分按常规体积比配制:10 X PCR Buffer、dNTPs和H2O和反应液中引物的体积比为5: 3: 36:10试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，其中包含有DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5’ -磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶，Taq聚合酶。其中，反向扩增引物SEQ ID N0.2的5’端进行生物素标记。正向扩增引物SEQ IDN0.1在纯度较好的情况下，也可以替代测序引物I使用。本专利技术的优点及有益效果: 本专利技术提供的一种检测线粒体基因突变的焦磷酸测序试剂盒，定性、定量准确，具有灵敏度高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点的频率分 析，结果直观。由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本专利技术的试剂盒能够对线粒体基因突变进行快速检测。本专利技术的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简单，反应时间短，高通量，比传统的毛细管电泳测序灵敏度高，更适合于突变的分析。【附图说明】 图1野生型线粒体基因1555位点焦磷酸测序结果。图2突变型型线粒体基因1555位点焦磷酸测序结果。图3野生型线粒体基因1494位点焦磷酸测序结果。图4突变型线粒体基因1494位点焦磷酸测序结果。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1试剂盒的制备 1、引物和探针的设计与合成 研究表明，目前与药物性耳聋密切相关的突变位点为1555、1494。使用PyroMark AssayDesign2.0软件设计引物；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID N0.2的5，端为生物素标记。扩增引物与测序引物序列为:正向扩增引物 SEQ ID N0.1:5，-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3，(mtDNA ntl463_1482)；反向扩增引物 SEQ ID N0.2:5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’(mtDNAntl673-1692)，扩增产物为 230bp ； 测序引物 I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，(mtDNA ntl464_1483)，用于检测线粒体基因C1494T突变； 测序引物2 SEQ ID N0.4:5，-TACGCATTTATATAGAGGAG-3，(mtDNA ntl535_1554)，用于检测线粒体基因A1555G突变。 实施例2试剂盒的使用 1、样本检测 溶解引物干粉(引物溶解后有效期为I个月)。按照模板数配制体系:取PCR反应液，加入溶解好的引物、UNG酶、Taq DNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。50 μ L反应体系各主要成分如下:PCR反应液45 μ L、UNG酶0.05 μ L、Taq酶0.5 μ L、正反向扩增引物各I μ L、模板2 μ L，其余为超纯水。该体系PCR 反应程序:(l)95°C，5min，l 个循环；(2) 95 °C, 30s, 50 °C, 30s, 72 °C,30s, 30 个循环；(3) 72°C,7min, I 个循环；(4) 4 °C, holding, I 个循环。扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，以进行下一步程序。2、焦磷酸测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测线粒体基因1555位A?G与1494位C?T突变的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括含有SEQ?ID?NO.1所示的正向扩增引物、SEQ?ID?NO.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示的测序引物1和测序引物2。

【技术特征摘要】
1.一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:试剂盒包括含有SEQ ID N0.1所示的正向扩增引物、SEQ ID N0.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示的测序引物I和测序引物2。2.根据权利要求1所述的检测线粒体基因A1555G与C1494T突变的试剂盒，其特征在于:正向扩增引物 SEQ ID N0.1:5’ -GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’ mtDNA ntl463_1482 ；反向扩增引物 SEQ ID N0.2:5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ mtDNA ntl673_1692 ；测序引物 I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，mtDNA ntl464_1483 ;测序引物 2SEQ ID N0.4:5’ -TACGCATTTATATAGAGGAG-3’ mtDNA ...

【专利技术属性】
技术研发人员：林文津，郭舜民，徐榕青，张亚敏，
申请(专利权)人：福建省医学科学研究院，
类型：发明
国别省市：