流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种流产嗜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列上MOMP的1个区域设计2条引物和一条探针，该试剂盒包括2×PremixExTaqTM缓冲液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明专利技术只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

Primer, reagent kit and detection method for real-time detection of Chlamydia trachomatis Taqman-MGB probe by real-time fluorescent quantitative PCR

The invention discloses a primer, a reagent kit and a detection method for real-time quantitative fluorescent quantitative PCR detection of a Taqman MGB probe of aborted Chlamydia trachomatis. 2 primers and a probe were designed according to the 1 regions of MOMP in the target sequence. The kit consisted of 2 * PremixExTaqTM buffer, positive control, negative control and sterilized deionized water. The invention only needs two step amplification method and simple reaction conditions can be fast, efficient, specific and highly sensitive detection of the target sequence, and the operation is simple, does not require expensive equipment and reagents, there is no technical requirement on operators, low detection cost, short detection time.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种。
技术介绍
衣原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物，在微生物分类中单独列目的一属球形、专性细胞内寄生的微生物。衣原体在分类学上属于原核细胞界、薄壁菌门、纲未定(衣原体与立克次氏体并列)、衣原体目、衣原体科。衣原体科又分为衣原体属和亲衣原体属，嗜性衣原体属包含嗜衣原体属，包括流产嗜衣原体iCh.1ortes)、豚鼠嗜衣原体iCh.cariae)、猫嗜衣原体(^?./Wis)、家畜嗜衣原体(^?.、肺炎嗜衣原体{Chlamydophila pneumoniae, CPn)和婴I踏热嗜衣原体 iChlamydophila psittac1、。它可以感染各种年龄的猪均能感染，但是临床上的表现是有所不同的。泛.abortus主要引起反.动物的流产，是全球性引起绵羊、?羊流产和经济损失的重要病原。本病除了引起绵羊、牛、山羊和猪流产和胎儿损失外,也能够引起与流产畜群接触人的流产。CL abortus H寄生于猪、牛、羊等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞，造成生殖道黏膜受损，导致以母畜流产、死胎、弱胎，公畜睾丸炎、尿道炎、龟头炎、包皮炎等为特征的慢性接触性传染病。由此可见流产嗜衣原体对畜牧业的危害，对人也存在一定的危害，因此对于本病的防控就显得尤为重要。荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针,3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至I个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。本文建立了针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对猪衣原体特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。TaqMan探针是一 种募核昔酸探针，突光基团链接在探针的5’末端,洋灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了 PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。中国专利技术专利(申请号为:200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan — MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测流产嗜衣原体的试剂盒及检测方法的报道。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种流产嗜衣原体TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于流产嗜衣原体TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒进行肉食品出入境检测的检测方法。为了实现上述第一目的本专利技术采用如下技术方案:本检测用引物包括流产嗜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.1;流产嗜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ IDN0.2 ;流产嗜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID N0.3。为了实现上述第二目的本专利技术采用如下技术方案:一种流产嗜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试 剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中: 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成: DNA序列为SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流产嗜衣原体上游引物0.4 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流产嗜衣原体下游引物0.4 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流产嗜衣原体MGB探针0.4 μ L ;2 X Premix Ex Taq 缓冲液 10 μ L ; 灭菌去尚子水7.8 μ L ; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为流产嗜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20 μ L ; 核苷酸序列为SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒 DNA; 所述阴性对照管，管内为无流产嗜衣原体感染的羊上皮组织基因组DNA，体积为20 μ L ； 所述灭菌去离子水管ImL~2mL。为实现上述第三目的本专利技术提供一种流产嗜衣原体Taqman — MGB探针实时荧光定量PCR检测方法:包括如下步骤: 1)制备待检模板DNA:选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA ； 2)扩增反应体系为:19μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20 μ L; 3)流产嗜衣原体荧光定量PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件:预变性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s (使用ABI 7500议采用34s) 40个循环；在58°C 30s进行荧光信号的采集。4)结果判定:将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。本专利技术的原理是:针对一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团NED, 3’端标记有非淬灭基团,本身不产生突光,可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任本文档来自技高网...

【技术保护点】
流产嗜衣原体Taqman?MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，其特征在于：包括流产嗜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ?ID?NO.1;流产嗜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ?ID?NO.2；流产嗜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ?ID?NO.3。

【技术特征摘要】
1.流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，其特征在于:包括流产嗜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.1; 流产嗜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.2 ； 流产嗜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID N0.3。2.流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于:包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中: 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成: DNA序列为SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流产嗜衣原体上游引物0.4 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流产嗜衣原体下游引物0.4 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流产嗜衣原体MGB探针0.4 μ L ;2X Premix Ex Taq 缓冲液 10 μ L ; 灭菌去尚子水7.8 μ L ; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为流产嗜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20 μ L ; 所述阴性对照管，管内为无流产嗜衣原体感染的羊上皮组织基因组DNA，体积为20 μ L ； 所述灭菌去离子水管ImL~2mL。3.根据权利要求2流产嗜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于:...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昱，聂福平，杨俊，李应国，袁曾壮，王国民，肖进文，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：