甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法技术

一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法，包括以下步骤：1)提取甘蔗叶片总DNA；2)在SSR引物的作用下进行PCR反应；3)PCR扩增产物的毛细管电泳分析；4)利用毛细管电泳产生的电泳峰的位置、高度和面积参数建立甘蔗样本DNA指纹图谱。本发明专利技术充分利用了甘蔗DNA中丰富的SSR遗传多样性，DNA指纹图谱信息量大、实用性强、结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景。

Construction of DNA fingerprint of sugarcane capillary electrophoresis and identification of Sugarcane Germplasm Resources

A method of capillary electrophoresis of sugarcane DNA fingerprint construction and identification of sugarcane germplasm resources, which comprises the following steps: 1) total DNA was extracted from sugarcane leaves; 2) PCR reaction in SSR primers.; 3) PCR amplification products analysis by capillary electrophoresis; 4) position, height and area of peaks produced by the parameters capillary electrophoresis to establish DNA fingerprints of samples of sugarcane. The invention makes full use of DNA SSR genetic diversity of sugarcane rich, DNA fingerprint of a large amount of information, practical, accurate, stable, good repeatability and high sensitivity, has very broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法
本专利技术涉及甘蔗品种资源鉴定技术，具体地说是一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法。
技术介绍
甘蔗是我国及世界重要的糖料作物。甘蔗在分类上属于禾本科甘蔗属(Saccharum)0目前，甘蔗品种资源的鉴别主要是依据外观性状。外观性状鉴别过于依赖鉴别人员的经验和感觉，主观性强，可信度较低。同时外观性状受环境影响大，也会导致鉴别错误，加之甘蔗品种的相似度越来越高，导致鉴别越来越困难。由于DNA遗传物质受环境影响小、多态性高，DNA指纹鉴定技术已成为作物品种鉴定最有效的方法，目前在甘蔗品种资源的鉴别方面也开始逐步应用。DNA指纹鉴定技术是利用生物体内遗传信息载体DNA对生物物种进行鉴别的方法，近年来已经被广泛地应用于植物品种资源的鉴定。目前应用于构建DNA指纹图谱的分子标记方法主要有:限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphisms, RFLP)分析技术，随机扩增 DNA 多态性(Random Amplified PolymorphicDNA,RAPD)分析技术，扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphisms,AFLP)分析技术,简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)分析技术,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析技术,在 RAPD 和 RFLP 技术基础上建立了序列特异性扩增区域(Sequence characterized amplified regions, SCAR)、酶切扩增多态序列(Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)和DNA扩增指纹(DNA amplifiedfingerprints, DAF)等分析技术。其中Moore等于1991年结合PCR技术创立了 SSR标记技术，SSR也称微卫星DNA，是一类由几个(多为I~6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10~60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了 SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。与其他分子标记技术相比，SSR具有如下优点:1.SSR引物是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计的，具有很强的特异性；2.SSR序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性；3.SSR重复性和稳定性好。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)具有快速、灵敏、分辨率高等优点。CE可以满足SSR分析对扩增产物高分辨率的要求，分辨率可达lbp，精确展现扩增结果的多态性；CE分析得到的电泳峰可以精确的定位PCR扩增产物迁移的位置，即PCR扩增产物的大小；CE分析得到的电泳峰的峰高和峰面积可以精确的反应PCR扩增产物的量。近年来，Cordeiro,G.M., Pan, Y.B., Henry, R.J.(2003).Sugarcanemicrosatellites for the assessment of genetic diversity in sugarcane germplasm.Plant Science, 165 (I)，181-189、梁俊，PAN Yong-Baoj 李杨瑞，方锋学.(2010).利用 SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析.广西植物，30 (I): 106-111，Qi，Y.1，Pan, Y.B.，Laoj F.Y.，Zhang, C.Μ.，Fan, L.N.，He，H.Y.，Liuj R.，Wang, Q.N.，Liuj S.M.，Liuj F.Y., Li, Q.W., Deng,Η.H.(2012).Genetic Structure and Diversity of ParentalCultivars Involved in China Mainland Sugarcane Breeding Programs as Inferredfrom DNA Microsatellites.Journal of Integrative Agriculture，11(11)，1794-1803 ;You, Q., Xuj L., Zheng, Y., Quej Y.(2013).Genetic Diversity Analysis of SugarcaneParents in Chinese Breeding Programmes Using gSSR Markers.The Scientific WorldJournal, 2013.等利用SSR分子标记结合毛细管电泳技术开展甘蔗种质资源遗传多样性等方面的研究。同时，在甘鹿DNA指纹图谱研究方面澳大利亚Piperidis, G.，Rattey, A.R., Taylor, G.0., Cox, M.C., (2004).DNA markers: A tool for identifying sugarcanevarieties.Austral Sugarcane, 8(suppl):1-8 ; 美国 Pan, Y.B.(2010).Databasingmolecular identities of sugarcane(Saccharum spp.) clones constructed withmicrosatellite (SSR)DNA markers.American Journal of Plant Sciences, I(2), 87-94.等研究者使用SSR分子标记结合毛细管电泳技术建立了各自的甘蔗分子身份证数据库。但是，不管是利用毛细管电泳开展甘蔗种质资源遗研究或者DNA指纹图谱方面的研究，所有的这些研究都是利用毛细管电泳峰的有无即数字化后的1、0数据进行分析研究，都没有涉及到毛细管电泳峰特征数据的利用，而本专利技术则是基于毛细管电泳峰的特征数据的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于甘蔗品种资源鉴别的基于毛细管电泳技术的DNA指纹图谱构建方法及鉴定方法。本专利技术通过以下技术方案达到上述目的:一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括下述步骤:I)甘蔗DNA提取:按CT AB、SDS或者DNA提取试剂盒等方法提取甘蔗DNA ；2)甘蔗DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物；3) PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱；4)毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积；5)毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为1，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化；6)利用对应PCR扩增产物的大小的电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：1）甘蔗DNA提取：按CTAB、SDS或者DNA提取试剂盒的方法提取甘蔗DNA；2）甘蔗DNA的PCR扩增：以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物；3）PCR扩增产物的分析：采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱；4)毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积；5)毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为1，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化；6)利用对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据标准化值构建甘蔗DNA指纹图谱。

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括下述步骤: O甘蔗DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取试剂盒的方法提取甘蔗DNA ； 2 )甘蔗DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物； 3)PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱； 4)毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积； 5)毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为1，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化； 6)利用对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据标准化值构建甘蔗DNA指纹图谱。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：周会，潘永保，李杨瑞，杨荣仲，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所，
类型：发明
国别省市：