利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法技术

一种利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明专利技术获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明专利技术已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合 成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物。
技术介绍
甘鹿（Saccharum officinarum)是最重要的糖料作物，鹿糖占我国食 糖总产的90%以上。甘蔗花叶病是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病害，它主 要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量 降低5% -19%、节间变短、品质变劣和品种退化。该病病原复杂，可由多种病毒引起，主 要为甘鹿花叶病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花叶病毒（Sorghum Mosaic Virus，SrMV)，属马铃薯Y病毒属（Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简 单，编码10个成熟蛋白，分别为PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。且该病 的侵染病毒极易分化，不同地区的分离物或株系均存在差异。在1997年已报道至少存在7 个株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和属于SrMV的株系SrMV-H，I，M，这些不同株 系的病毒均可引起甘蔗花叶病的发生。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标 的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。 RNA干扰（RNA interference，RNAi)是一种转录后基因表达沉默机制，构建可转 录为双链RNA(dsRNA)的植物表达载体转化植物，可实现植物目标基因的可遗传的基因沉 默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基 因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是 多个不同病毒的基因片段。为此，我们采用RNAi技术，将收集到的ScMV各病毒株系的核酸 序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，并从多序列比对结果中分别选 出两条100%同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi干扰片段，构建 反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得具有沉默病 毒基因表达效果的转基因甘蔗。 专利号为ZL20071009226. 8的专利技术专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P :基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用人工合成序列MV5培育抗花叶病甘蔗品 种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高 粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花 叶病高抗的转基因甘蔗。 本专利技术的目的是通过以下方法实现的。 本专利技术的利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的 人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在 于： (1)MV5序列的人工合成： 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义 链5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用 人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下： GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA ATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC TCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG 所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，指分别将收集到的 ScMV各个病毒株系的核酸序列和SrMV各个病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从 中分别各选取2条长度大于40bp，且100%同源的序列区段串联在一起，共262bp，为目标 RNAi干扰序列。 (2) RNAi干扰载体构建： (a)目的片段I的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I ;目的片段I的序列为序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； (b)目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，目的片段II的序 列为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列； (c)中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B ;所述中 间载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体； ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和 Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III ;目的片段III 的序列为序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (e)目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切， 将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV ;目的片段IV的序列为序列表 中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； (f)中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C ;所述中 间载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体； (g)目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V ;目的片段V的序列为 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； (h)目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶 Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列； ⑴抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MV5的获得：将回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆 验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV5 ; (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：(1)MV5序列的人工合成：从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAGCTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAAATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGACTCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGCGCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG；(2)RNAi干扰载体构建：(a)目的片段Ⅰ的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；目的片段Ⅰ的序列为序列表中SEQID NO:2所示的核苷酸序列；(b)目的片段Ⅱ的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，目的片段Ⅱ的序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(c)中间载体B的获得：将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；所述中间载体B是指将目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；(d)目的片段Ⅲ的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；目的片段Ⅲ的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；(e)目的片段Ⅳ的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ；目的片段Ⅳ的序列为序列表中SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；(f)中间载体C的获得：将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；所述中间载体C是指将目的片段Ⅳ插入到中间载体B后获得的载体；(g)目的片段Ⅴ的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ；目的片段Ⅴ的序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；(h)目的片段Ⅵ的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ；目的片段Ⅵ的序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；(i)抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i‑MV5的获得：将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i‑MV5；(3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229i‑MV5质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μl，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高世武，郭晋隆，许莉萍，阙友雄，苏亚春，吴期滨，高世宇，林庆良，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35