一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因的扩增引物制造技术

本发明专利技术利用通用引物扩增得到的53条鸟蛤科16S rRNA序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier5设计出3对引物，用鸟蛤科24个种的218个个体在10μl体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因序列特异性扩增引物，其特征是：NG16Sa5’-GCCTGTTTATCAAAAACATCTC-3’NG16Sb5’-TCTGAACTCAGATCACGTAAGGAT-3’采用本发明专利技术的鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA引物，可以快速、高效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，扩增效率达100％，为鸟蛤科物种的鉴定、地理种群鉴别、种质资源和遗传多样性的研究提供支持，为进一步开发鸟蛤科各重要经济贝类人工养殖提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鸟給贝类线粒体16S rRNA基因扩增引物。
技术介绍
鸟蛤科(Cardiidae)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)。鸟蛤科贝类物种丰富、大小不一，全世界约250种，我国发现的约50种，小的直径约I公分，大的直径能达到15公分(如加利福尼亚的光滑巨鸟蛤)。鸟蛤为世界性分布，常栖息在印度洋-西太平洋海域的浅海中，在新加坡、日本、澳大利亚、马来西亚、印度尼西亚、中国大陆、台湾及南海诸岛等地均有分布。鸟蛤科贝类包含滑顶薄壳鸟蛤、加州扁鸟蛤、黄边糙鸟蛤、中华鸟蛤等在水产养殖及捕捞上具有重要价值的种类，是一个具有很高的经济价值的大类群。传统的分类主要是依据壳的形状，壳表的颜色，放射肋的数目、二级结构和肋间沟的宽窄来区分鸟蛤科不同物种，例如，单色糙鸟蛤和砂糙鸟蛤其形态学区别为前者较大，放射肋约46条，而后者较小，约有45条放射肋。这些形态学鉴定指标不稳定、可塑性强、可明确的量化特征少，对专业要求很高且带有很强的主观倾向性，单靠形态学特征极易导致错误的鉴定。而且鸟蛤科含有大量近缘种，近缘种之间的形态学差异细微，故相当大一部分鸟蛤科贝类种间关系一直存在争议，分类十分混乱。近年来，随着分子技术不断发展，利用DNA序列对物种进行分类和系统发育分析已成为一种高效而简单的方法，特别是鉴定形态不易区分或缺少形态学数据的种。其中线粒体16SrRNA基因因其单亲遗传，无重组，中性进化，突变速率适中等特点成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想基因之一。该基因一经引用就迅速传播开来，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用。因此，利用16S rRNA基因对鸟蛤科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很有前景的方法。然而贝类16S rRNA序 列的变异速率明显高于动物的其他类群，软体动物不同物种，即使是近缘种甚至种内不同群体之间的16S rRNA序列变异都很大，因此其非特异性扩增引物的扩增效率低下，有些物种根本无法扩出。缺少扩增效率高的引物严重阻碍了这种分子标记应用，因此筛选鸟蛤科线粒体16S rRNA基因特异性扩增引物，对利用分子方法鉴定鸟蛤科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用16S rRNA基因研究鸟蛤系统地理学、保护鸟蛤科种质资源和选择合适的养殖品种提供技术条件。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本专利技术根据鸟蛤科物种16S rRNA基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验，筛选出鸟蛤科贝类16S rRNA基因特异性扩增引物。采用本专利技术的16S rRNA基因扩增引物，可以有效的扩增出鸟蛤科不同物种的16S rRNA序列，更有利于鸟蛤科的物种遗传多样性的研究。具体实施例方式本专利技术的鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法采用三个步骤:a、利用16S rRNA通用扩增引物扩增出部分鸟蛤科物种的16S rRNA序列；b、从上述得到的鸟蛤科16SrRNA序列中，通过比对找出保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；c、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增鸟蛤科线粒体16S rRNA基因效果最好的一对引物。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明:1.样品采集:于2000年 2012年，从中国南北沿海共采集鸟蛤科12个属24个种类的218个个体。2.DNA提取:用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。3.16S rRNA通用扩增引物扩增:利用Palumbi于1996年设计的16S rRNA通用扩增引物16S rRNAar(5’ -CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3 ’ )16S rRNAbr(5，-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3，)对上述采集的鸟蛤科218个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为42V 50°C。扩增产物经1.5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得10个种53个个体的5.弓丨物合成:根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出3对扩增引物。6.引物扩增:将上述设计的3对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的鸟蛤科24个种类的218个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同，PCR热循环退火温度范围为42°C 48°C。扩增产物用1.5倍的琼脂糖电泳进行检测。7.引物扩增结果:上述3对扩增引物中，I对引物扩增出20个个体，I对引物能扩增出47个个体，I对引物能扩增出鸟蛤科全部的218个个体，扩增效果非常好。8.特异性扩增引物序列:经过大量的重复试验，最终筛选出上述扩增鸟蛤科16SrRNA 基因效果最好的一对引物序列为:NG16Sa5’ -GCCTGITTATCAAAAACATCTC-3’ ；NG16Sb5’-TCTGAACTCAGATCACGTAAGGAT-3’。 利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为500bp。9.特异性扩增引物扩增条件:上述NG16Sa与NG16Sb扩增引物的10 U LPCR反应体系为:1 U LlOXbuffer Mg2+, I u L DNTP (2mM), 0.6 u L Mgcl2 (25mM)，I y L 弓I 物NG16Sa(10iiM)，liiL 引物 NG16Sb (10 y M)，0.08 y L r-Taq (5u/ u L), I U LDNA 板，4.32 u L双蒸水。PCR热循环的退火温度为42 V 48°C。权利要求1.一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因的扩增引物，其特征是NG16Sa5’-GCCTGTTTATCAAAAACATCTC-3’、NG16Sb5’` -TCTGAACTCAGATCACGTAAGGAT-3’。全文摘要本专利技术利用通用引物扩增得到的53条鸟蛤科16S rRNA序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier5设计出3对引物，用鸟蛤科24个种的218个个体在10μl体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因序列特异性扩增引物，其特征是NG16Sa5’-GCCTGTTTATCAAAAACATCTC-3’NG16Sb5’-TCTGAACTCAGATCACGTAAGGAT-3’采用本专利技术的鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA引物，可以快速、高效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，扩增效率达100％，为鸟蛤科物种的鉴定、地理种群鉴别、种质资源和遗传多样性的研究提供支持，为进一步开发鸟蛤科各重要经济贝类人工养殖提供基础。文档编号C12Q1/68GK103103186SQ20131004081公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日专利技术者李琪, 于贞贞, 孔令锋 申请人:中国海洋大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸟蛤科贝类线粒体16S rRNA基因的扩增引物，其特征是NG16Sa5’‑GCCTGTTTATCAAAAACATCTC‑3’、NG16Sb5’‑TCTGAACTCAGATCACGTAAGGAT‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李琪，于贞贞，孔令锋，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37