Y型探针及其变形型及利用该Y型探针的DNA微陈列、试剂盒以及基因分析方法技术

本发明专利技术涉及在基因型检测及分析时，可通过改善灵敏度、特异度及准确度来广泛用于诊断的，在一个本体内具有两个探针部位的Y型核苷酸探针（probe）及利用该Y型核苷酸探针（probe）的DNA微陈列、试剂盒以及基因分析方法。本Y型探针的结构由左侧探针部分、左侧茎区部分、连接肽（linker）、右侧茎区部分以及右侧探针部分等五种部位形成。本发明专利技术的DNA微陈列同时重复检索相同的基因，或者同时检索不同的两个靶基因，由此能够提高检测的准确度。尤其是，在一个点（spot）同时检索靶基因和对照基因，由此在分析时减少错误，并可实现定量分析，还能容易实现标准化。本发明专利技术的Y型探针均可利用于基因型分析、基因表达分析、突变或者SNP分析，并且可广泛利用于疾病诊断和预测、治疗决策等基因诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在基因型检测及分析时，可通过改善灵敏度、特异度及准确度来广泛用于诊断的，在ー个本体内具有两 个探针部位的Y型核苷酸探针(probe)及其变形型(d型或者b型探针)，以及利用该Y型核苷酸探针的DNA微陈列、试剂盒以及基因分析方法。
技术介绍
DNA微陈列或者DNA芯片是在载玻片等固相载体(solid support)上，以点(spot)方式，点样了数十个至数亿个基因探针的。在DNA微陈列上，放置从组织或者细胞、体液等检体中提取之后，用荧光物质(fluorescent dye)等来标记的DNA、RNA、cDNA、cRNA、微小RNA、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction; PCR)产物等核酸,并执行杂交反应或者测序(sequencing)反应,可通过突光扫描机等设备来分析在其反应中出现的标记物质的信号。据此，通过一次实验可勘察大单位基因的表达变化或者基因型(genotype)。DNA微陈列是迄今在基因相关研究或者临床诊疗当中不可缺少的工具，该DNA微陈列利用于基因的功能和基因组研究等基础科学研究，而且掌握基因疾病的机制，并树立诊断指针，查明特定药物的作用机制和副作用，并可广泛利用于设定疾病的治疗决策等临床诊疗(PetrikJ.Diagnostic applications of microarrays.Transfusion Medicine.2006;16:233—247;Wheelan SJ，Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinking world of DNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):726-732;Li X，Quigg RJ，Zhou J，Gu W,Nagesh RaoP, Reed EF.Clinical utility of microarrays:current status, existing challengesand future outlook.Current Genomics.2008;9 (7):466_74)。DNA微陈列根据置于其上或者点样(spotting)在其上的探针的种类，划分为寡核苷酸微陈列和置有cDNA或PCR产物的其他微陈列等两种DNA微陈列。作为迄今实现商业化的微陈列，大部分主要使用寡核苷酸微陈列。寡核苷酸微陈列根据其制备方法大体上可划分为两种。一个是在固相载体上直接合成寡核苷酸的，可举例光版印刷(photolithograpy)方式的昂飞(Affymetrix)公司的芯片、喷墨方式的安捷伦(Agilent)公司的芯片、电子合成方式的科恩比矩阵(Combimatrix)公司的芯片、光化学合成方式的罗氏(Nimblegen)公司的芯片等。另ー个是在固相载体上点样(spotting)或者印上另行预先制备的寡核苷酸探针的方法。目前处于后者更为广泛利用的趋势，作为代表性的例子可举例应用生物系统(Applied Biosystem Inc, ABI)公司的产品、柯德尔墨水(Codel ink)公司的产品以及光照派(Illumina)公司的产品等。这些微陈列产品上点样了长度为18个至75个碱基(bp)的单链的直线型(liner, single strand)寡核苷酸探针，点的数量多样,最少为12000个,最多为 10亿 7200 万个(Wheelan SJ, Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinkingworld of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008 ；4 (7):726_732)。DNA微陈列执行以往常 规的基因检测进行过的三种工作，但是，该DNA微陈列与以往的基因检测法的不同点在于:能够以所谓高吞吐量(high-throughput)或大单位一下子检测多个基因，由此大大减少时间和费用，还可应用于临床诊断。利用DNA微陈列的第一检测法是寻出特定碱基序列的基因是否存在于检体内的定性分析(qualitative analysis)。例如是将成为疾病的病原菌的固有基因的碱基序列用作探针来制备微陈列，在其上放置检体的核酸进行杂交反应，由此寻出靶基因来诊断病原菌的方法。利用这种所谓基因型分析(genotyping)，可准确掌握作为宫颈癌病原菌的人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)或作为流感病原菌的流行性感冒病毒(influenza virus)、性感染病原菌的种类以及菌株或亚种(strain)。而且，由于掌握是否存在各个癌症固有的基因，还可诊断特定癌症。还可预测要检测的细菌或癌症的恶性度或预后是否产生药物反应及副作用。这还可以用低密度(low density)微陈列来实现,具有制备容易，费用低廉，有用于临床诊断的优点，是在商业化最容易实现的形态的DNA芯片(I^SM, Choi TH, Lee SY,Yoo NC.Applications of DNA microarray in disease diagnostics.T Microbiol Biotechnol.2009:19 (7):635-46)。利用DNA微陈列的第二检测法是，用于确认特定碱基序列的基因在检体内存在多少的定量分析(quantitative analysis)。这将是首次登场的cDNA微陈列表现的检测法(Shena M, Shalon D, Davis Rff,Broiwn P0.Quantitative monitoring of gene expressionpattern with a amplementary DNA microarray.Science.1995; 270:467-470)。在微陈列内点样要勘察的基因的多个探针，并用分别不同的荧光染料(fluorescent dye)标记靶物质或靶疾病的对照物质或者对照组的RNA或cDNA、cRNA之后，置于微陈列上进行杂交反应，由此掌握基因表达时，两组之间究竟出现何种差异的方法。利用DNA微陈列的第三检测法是，用于确认基因的碱基序列的变化，具体是检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)、点突变(point mutation)或者缺失(deletion)的方法,进而,还可以确认特定基因的复制数(copy number)。通常,针对要分析的碱基分别采用单碱基的寡核苷酸探针分为野生型(wild type)和突变型(mutantor variant type) 2种,或者分为A、C、G、T等4个种类,然后在微陈列上点样，由此制备DNA芯片。随后，利用ー种方法:在其上放置检体DNA或cDNA，或者放置PCR产物，并在非常严格的条件(highly stringent condition)下执行杂交反应,来寻 出完全一致的探针。即，在微陈列上利用等位基因特异性寡核苷酸杂交法(allele specific oligonucleotidehybridization, ASH)或杂交测序(sequencing by hybridization, S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.26 KR 10-2010-00180081.一种Y字形的核苷酸探针，其特征在于，在一个本体具有两个探针部位。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，上述探针向5’一3’的方向以及从左侧上方朝向右侧上方的方向，依次由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位以及(5)右侧探针部位形成。3.一种d字形的核苷酸探针，其特征在于，根据权利要求2所述的探针的(I)左侧探针部位被去除，由(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位及(5)右侧探针部位形成。4.一种b字形的核苷酸探针，其特征在于，根据权利要求2所述的探针的(5)右侧探针部位被去除，由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位及(4)右侧茎区部位形成。5.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构； 上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，在分别相对于左侧茎区部位或者右侧茎区部位的整体喊基序列中，包含一半以上的G喊基。6.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构； 莖区部位的喊基序列包含端 粒的喊基序列。7.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，由碱基单体反复一次以上而形成，上述碱基单体选自包含以下的碱基单体的组中:TTGGG、TAGGG、TTGGGG、TTTGGG、TTAGGG、TTTGGGG、TTTAGGG、TTTTGGGG、TTTAGGGG。8.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位或者右侧探针部位是具有与靶基因互补的碱基序列的寡核苷酸。9.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位或者右侧探针部位是具有15个至150个的碱基序列的寡核苷酸。10.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 就上述左侧探针部位而言，从上方到下方的碱基序列以5’ 一3’的顺序排列； 就上述右侧探针部位而言，从下方到上方的碱基序列以5’ 一3’的顺序排列。11.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述连接肽部位为了与包被醛固相载体相结合，由作为氨基改性双脱氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。12.根据权利要求1至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述探针由肽核酸(PNA)形成。13.根据权利要求1至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述探针通过合成方法来制备而得，该合成方法包括以下步骤: 1)脱除三苯甲基步骤； 2)偶联步骤； 3)加帽步骤；以及 4)氧化步骤。14. 根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与一个靶基因内的两个相互不同的部位互补的碱基序列。15.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有与一个靶基因内的相同的部位互补的碱基序列。16.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与相互不同的靶基因互补的碱基序列。17.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于， 上述左侧探针部位和右侧探针部位中的一侧探针部位由具有与祀基因互补的喊基序列的寡核苷酸形成； 剩余的一侧探针部位由具有与对照基因互补的碱基序列的寡核苷酸形成。18.根据权利要求17所述的探针，其特征在于，上述对照基因不与靶基因具有互补性，并且在检体中不存在或者表达。19.根据权利要求17所述的探针，其特征在于，上述对照基因是大肠杆菌的motD基因。20.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述探针是具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的寡核苷酸。21.一种DNA微陈列，其特征在于，根据权利要求1至4中的任一项所述的探针在固相载体进行点样而形成。22.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述固相载体选自包含载玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龙膜的组中。23.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述DNA微陈列还点样了人β—珠蛋白基因。24.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，作为上述探针的点样部位的加样孔划分为8个。25.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的检测及基因型分析。26.根据权利要求25所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针与具有5’末端由Cy5来标记的序列号4的碱基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3来标记的序列号I的碱基序列的寡核苷酸引物互补地相结合。27.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上...

【专利技术属性】
技术研发人员：文宇哲，吴明烈，
申请(专利权)人：固德基因公司，
类型：
国别省市：