高产量分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法技术

本发明专利技术涉及从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤a)通过将所述样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中含有的核酸结合固相，b)在靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理，c)收集所述步骤b)处理中从所述固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物，d)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接触核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合所述核酸结合固相，e)可选进行洗脱。本发明专利技术引起分离靶核酸中的小靶核酸产量显著增加，因为其能有效捕获和回收小靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，且特定提供从样品中以高产量有效分离小靶核酸的方式。研究来自各种组织、体液和生物体的1000或500核苷酸或更小范围的小核酸是引起极大兴趣的领域且将来仍会保持。小核酸特定包括但不限于小RNA如微RNA (miRNA)和小干扰RNA分子等，二者都对基因表达有显著效果。此外，对参与mRNA和rRNA加工的其他小核RNA和小核仁RNA(如snRNA和snoRNA)以及小DNA分子也感兴趣。此外，长度为1000或500核苷酸或更小的核酸通常还作为降解产物包含在特定样品中，所述样品如福尔马林固定和石蜡包埋的样品(FFPE样品)，因为各保存措施可能破坏DNA和/或RNA完整性。随着对各小核酸的兴趣不断增大，已改良标准分离过程以促进分离小核酸并特定提高小核酸产量。所述用作分离DNA或RNA标准的已知操作通常对于分离小核酸不理想，因为小核酸通常不能在分离过程中用标准方法有效捕获和洗脱。因此，用标准过程从样品中分离靶核酸一般不包括足够量的小靶核酸并从而提供可接受的产量，这是因为小核酸在核酸分离过程中不结合或丧失。因此，需要改善的技术用于有效分离小靶核酸，单独或作为已分离总靶核酸如总RNA或总DNA的一部分。就分离小核酸优化的方法通常依赖于苯酚和氯仿提取以及逐步醇分级分离。根据一个实施方式，RNA在水相中浓缩并随后从中分离，例如通过加入至少一种醇和使RNA结合膜。在此，有效捕获已分离总RNA中的小RNA也很重要。此外，开发了分离小核酸如小RNA的方法，所述方法包括使用离液剂、高浓度醇和核酸结合柱，所述柱包含例如核酸结合膜如二氧化硅膜。如果各小RNA包含在样品中，用这些操作分离的总RNA包括小RNA。各基于膜的分离操作特别适于从各种样品中分离小核酸，单独或作为总靶核酸的一部分。 然而，使用基于固相的柱以结合核酸(例如柱包括核酸结合膜)的许多核酸分离方法在靶核酸结合核酸结合相(也称为如“膜上”或“柱上”处理步骤)时涉及一种或多种水溶液的一个或多个处理步骤。所述核酸结合核酸结合固相时进行的各处理步骤示例包括但不限于蛋白消化步骤和核酸酶消化步骤如DNA酶或RNA酶处理。发现运行各处理步骤减少靶核酸产量且特定减少小靶核酸产量，因为所述处理具有以下效果:至少一部分已结合靶核酸且特定是小靶核酸在所述处理步骤中从所述核酸结合固相中释放。因此，为防止释放的核酸在随后洗涤或加工步骤中丧失，现有技术已知应用例如在进行处理后恢复合适结合条件的离液溶液(例如离液洗涤液)以恢复可能释放的靶核酸与核酸结合相的结合。各恢复步骤例如描述于W098/59076且还用于许多市售可得的核酸分离试剂盒。然而，发现尽管进行各恢复步骤以恢复可能释放的靶核酸与核酸结合固相的结合，小靶核酸在分离工艺中最终仍丧失。用基于柱的固相以结合所述核酸来分离核酸时，例如用含核酸结合膜的柱时，尤其如此。因此，仍需要改善以增加已分离靶核酸中的小核酸产量。因此，本专利技术目的是提供分离至少一种靶核酸的方法，所述靶核酸包括小靶核酸或可由其组成，其中所述小靶核酸产量增加。
技术实现思路
本专利技术是基于以下发现:如果使用基于柱的核酸结合固相，核酸结合核酸结合固相时在进行例如酶处理后应用恢复缓冲液或促结合洗涤缓冲液不足以用于重捕获并因而以可接受产量分离所述处理中释放的小靶核酸。随后，会根据优选实施方式解释，其中核酸结合膜用作固相。不受理论约束，推断膜上处理中释放的至少一部分小靶核酸位于膜下方和/或膜孔下深处。各“逃逸”小靶核酸不能通过应用恢复缓冲液(或促结合洗涤缓冲液)而有效重结合，因为其不接触所述膜的核酸结合区域，并因此在随后加工步骤中丧失。用其他基于柱的核酸结合固相时，特别是如果核酸结合固相仅形成例如柱中的薄层，发生类似问题。本专利技术教授收集这些“逃逸”小靶核酸并使其结合核酸结合固相。因此，这些“逃逸”小靶核酸(进行现有技术方法时丧失)还能在靶核酸分离工艺中有效捕获，从而增加已分离靶核酸中小靶核酸的产量。因此，根据本专利技术的方法能以提高的产量分离小靶核酸并从而提供相对现有技术已知方法显著的优势。因此，根据第一方面，提供从样品分离至少一种包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤a)通过将样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中所含核酸结合固相，b)在靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理，c)收集所述步骤b)处理中从固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物，d)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接触所述核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合核酸结合固相，e)可选进行洗脱。根据一方面，提供从样品分离至少一种包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤 a)通过将样品经过核酸结合膜来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述膜，b)在靶核酸结合所述膜时对膜进行涉及水溶液的处理，c)使回收溶液通过所述膜并收集含小靶核酸的流出物，d)使所述流出物通过步骤a)的膜以将所含小靶核酸重结合所述膜，e)可选从所述膜洗脱包括小核酸在内的靶核酸。此外，本专利技术涉及应用能使小核酸结合柱中所含核酸结合固相的回收溶液，用于在核酸结合所述固相时重结合在先前进行的处理中从所述核酸结合固相释放并优选收集为流出物的小核酸。此外，本专利技术涉及运行本专利技术所述方法的试剂盒，包括:a)柱中所含的核酸结合固相，优选膜；b)含有离液剂和醇的结合缓冲液，用于使包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述核酸结合固相；c)回收溶液，包含浓度为0，5M-多至饱和极限的离液剂和浓度为至少50%的醇；和d)运行本专利技术所述方法的说明书。遵循下列描述和所附权利要求，本应用的其他目的、特征、优势和方面对本领域技术人员显而易见。然而，应理解阐述所述应用的优选实施方式时，下列描述、所附权利要求、和特定实施例仅通过说明方式给出。在所公开专利技术精神和范围内的各种变化和修改通过阅读下列内容会对本领域技术人员显而易见。附图简要说明附图说明图1-3显示用安捷伦(Agilent)生物分析仪从肾组织分离的RNA大小分布。“ + ”鉴定用本专利技术所述方法分离的RNA且鉴定用参考方法分离的RNA。小RNA部分用箭头标记。图4显示RNA分离后的miR16检测试验结果，用不同回收溶液或参考方法进行本专利技术所述方法，其中不使用各回收溶液。可见用本专利技术所述回收溶液，Ct值显著下降，从而证明小RNA分离改善。图5显示用5个不同试剂盒纯化的RNA加样的琼脂糖凝胶照片(参见实施例7)。右侧箭头标记小RNA。图6的图表显示用Cjun mRNA的实时PCR结果(参见实施例7)。从获自3种不同大鼠组织的FFPE样品纯化RNA:1.肝(包埋2个月)，2.肾(包埋19个月)和3.肺(包埋8个月)。图7的图表显示用miR29a的微RNA分析结果(参见实施例7)。图8a和8b描述用不同供应商试剂盒纯化的DNA的实时PCR分析结果(参见实施例7)。从获自3种不同大鼠组织的FFPE样品纯化DNA:1.肝(包埋2个月)，2.肾(包埋19个月)和3.肺(包埋8个月)。图8a中，就所有样品而言模板体积相同，图Sb中，使用相同模板浓度。图9a和9b的图表显示实时PCR实验结果以分析Madh7RNA (参见实施例7)。从获自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.02 EP 10009130.51.一种从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤: a)通过将所述样品经过柱来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述柱中含有的核酸结合固相， b)在所述靶核酸结合所述固相时对核酸结合固相进行酶和/或化学处理， c)收集所述步骤b)处理中从所述固相释放的至少一部分小靶核酸作为流出物， d)将含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接触核酸结合固相，用以将所含小靶核酸结合所述核酸结合固相， e)可选进行洗脱。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，用于步骤a)的所述核酸结合固相是膜。3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)中回收溶液通过所述柱且收集含小靶核酸和所述回收溶液的流出物并用于步骤d)，优选用于使流出物所含的小靶核酸重结合步骤a)所用的核酸结合固相。4.一种从样品分离包括小靶核酸在内的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步骤: a)通过将所述样品经过核酸结合膜来使至少一部分包括小靶核酸在内的靶核酸结合所述膜， b)在所述靶核酸 结合所述膜时对膜进行涉及水溶液的处理， c)使回收溶液通过所述膜并收集含小靶核酸的流出物， d)使所述流出物通过步骤a)的膜以将所含小靶核酸重结合所述膜， e)可选从所述膜洗脱包括小核酸在内的靶核酸。5.按权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述酶和/或化学处理在步骤b)中进行，包含使用水溶液且选自核酸酶消化步骤、蛋白消化步骤、脂酶消化步骤和靶核酸修饰步骤。6.按权利要求1-5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中进行的处理涉及引起至少部分靶核酸，尤其是小靶核酸从所述核酸结合固相释放的条件。7.按权利要求1-6中一项或多项所述的方法,其特征在于,所述回收溶液具有一种或多种下列特征: a)提供适于使小核酸结合步骤d)所用的核酸结合固相的条件； b)就结合小核酸而言，提供比步骤a)所用的结合条件更强的结合条件； c)提供适于使小RNA结合步骤d)所用的核酸结合固相的条件； d)提供适于使小DNA结合步骤d)所用的核酸结合固相的条件； e)包含至少一种离...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·霍兰德，G·克里斯托夫，M·施卢姆贝格尔，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：
国别省市：