分离DNA污染物降低的经纯化的RNA的方法技术

本发明专利技术涉及从含RNA和DNA的样品中分离RNA的方法，所述方法包括：a)向样品中添加包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物;b)添加不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA和蛋白质聚集于所述有机相和/或中间相。c)从所述水相分离所述RNA。其中在分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。已发现，添加至少一种阳离子去污剂显著降低所述含RNA的水相中的DNA含量。因此，本发明专利技术使得简便地分离含显著较少DNA污染物的纯RNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离DNA污染物降低的经纯化的RNA的方法 本专利技术涉及从含RNA和DNA的样品中分离经纯化的RNA的方法，其中经纯化的RNA中DNA污染物含量降低。另外，本专利技术涉及用于所述目的的组合物和方法。分离纯化的、完整的RNA是分子生物学、临床和生物技术应用中基因表达分析的关键步骤。现有技术中发展了许多达到该目标的方法。分离RNA最常用的方法是基于苯酚提取、用离液盐沉淀以及二氧化硅吸附的方法。例如在US4，843，155和US2008/057560中描述了使用离液盐的基于苯酚一氯仿的方法。相应方法使得从同一样品中分离纯RNA，或分离RNA、DNA和任选的蛋白质。相应方法的原理是将样品于含苯酚和离液剂的变性组合物中匀化。该匀化物通过添加不溶于水的有机溶剂，例如氯仿，来分相。接着离心，所述混合物分成含RNA的水相以及含DNA和蛋白质的中间相和有机相。为分离RNA，收集所述水相并从中分离RNA，例如通过在所述水相中加入醇来沉淀RNA。相应方法提供了基本上纯化的、未降解的RNA。然而，根据相应基于苯酚一氯仿的方法所分离的RNA中含DNA残量,该残量可通过例如逆转录聚合酶链反应试验(RT-PCR)检测。所述残留DNA污染物会干扰所纯化RNA的下游应用。这就产生了问题，因为污染DNA可作为DNA聚合酶的模版，因此可能产生附加的扩增产物并因此影响RNA —依赖性RT-PCR的实施。因此，使用相应方法分离的RNA必须进一步纯化来得到不含DNA的纯化RNA。因此，可尝试通过降低纯化RNA中的DNA污染物含量来改进现有技术中分离的RNA的品质。一种移除污染DNA的常用实践是用DNA酶处理含RNA的样品。然而，实施相应的DNA酶处理有缺点，因为其增加了成本和处理步骤，而且DNA酶可能包含痕量RNA酶，因而产生RNA降解的风险。其他降低DNA污染物的尝试包括从水相中沉淀DNA的附加步骤。改进的方法中另外还使用了核酸结合固相以及需要合适的结合条件来将DNA结合到所述固相，以将DNA污染物从含RNA的水相中移除。然而，相应方法也有缺点，因为其必须使用额外的核酸结合固相以及额外的处理步骤因而增加了成本。另一种降低DNA污染物的方法是基于在苯酚提取期间将pH值降至4以下(例如请参考US2008/0057560)然而，所述方法中分离的RNA中的DNA污染物也没有得到令人满意的降低。因此，本专利技术的一个目的是特别提供一种从含RNA、DNA和任选的蛋白质的样品中分离RNA的方法，所述方法产生纯RNA并降低经分离的RNA中DNA污染物的含量另外，本专利技术的一个目的是降低含RNA的水相(尤其是通过苯酚/氯仿提取或相似的分相生产方法所获得的)中的DNA含量。
技术实现思路
本专利技术是基于以下发现:向样品中添加至少一种阳离子去污剂可显著减少经分离的RNA中DNA含量，所述样品经过以下处理:添加含离液剂和苯酚的酸性变性组合物。添加所述阳离子去污剂产生了令人意外的效果:通过添加不溶于水的有机溶剂，例如氯仿，获得含RNA的水相，所述水相中的DNA残留量显著减少。不受理论的限制，可认为添加阳离子去污剂具有以下效果:更多DNA从含R NA的水相中移除并由此导入相分离期间形成的中间相和/或有机相中。因此，通过添加阳离子去污剂，所述DNA有效地从含RNA的水相中移除并聚集在所得的中间相和/或有机相中。其显著减低了后续从所述水相中分离的RNA中DNA污染物的含量。因此，本专利技术提供了相对于现有技术的显著优点，并免去了从含RNA水相中去除DNA污染物的处理，例如DNA酶处理或使用特异性核酸结合相去除DNA污染物或额外的纯化步骤。根据本专利技术的第一方面，提供一种从含RNA和DNA的样品中至少分离RNA的方法，所述方法包括以下步骤:a)向样品中加入包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物；b)加入不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA聚集于所述有机相和/或中间相；以及 c)从所述水相分离所述RNA。其中在最终分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。如上文所述，如果使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物制备样品，那么在最终分离各相前添加至少一种阳性去污剂可产生如下效果:含RNA的水相中的DNA污染物显著降低。根据本专利技术的第二方面，提供一种用于本专利技术所述方法的试剂盒，包括:a)含离液剂和苯酚的酸性变性组合物；b)至少含一种阳离子去污剂的用于降低DNA污染物的溶液；c)任选的核酸结合固相以及 d)任选的洗涤和洗脱缓冲液。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种降低含RNA水相中DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分离方法涉及使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物，其中，将至少一种阳离子去污剂加入经所述酸性变性组合物匀化的样品中，之后通过添加不溶于水的有机溶剂将所得相分为水相、任选的中间相和有机相。根据第四方面，本专利技术涉及用至少一种阳离子去污剂来降低含RNA水相中DNA含量，所述含RNA水相通过以下步骤得到:-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；-添加不溶于水的有机溶剂并且-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。其中在最终分离所述各相前添加阳离子去污剂。根据第四方面，本专利技术涉及使用至少一种阳离子去污剂，通过降低含RNA水相中DNA含量，来提高任选的中间相和/或有机中DNA含量，其可通过以下步骤得到:-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；-添加不溶于水的有机溶剂并且-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。其中在最终分离所述相前添加阳离子去污剂。如上文所述，当在含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中制备样品时，添加阳离子去污剂之后再分离所述相可显著降低含RNA水相中的DNA含量。所述方法使得例如分离到含较少DNA污染物的纯RNA。通过以下说明书和附加的权利要求书，本领域技术人员能明白本专利技术的其它目的、特征和优点。然而，应当理解虽然下述详细说明，附加的权利要求和具体实施例描述了本专利技术的优选实施方式，其仅通过举例方式给予。通过阅读以下内容，本领域的技术人员很容易明白在本专利技术所公开的主旨和范围中所做的各种改变和修改。专利技术详述本专利技术涉及基于使用苯酚、离液剂和不溶于水的有机溶剂(例如氯仿)的RNA分离方法。在相应方法中，形成包含含有RNA的水相、任选的中间相和有机相的多相混合物。DNA和蛋白质(如果包含在样品中)包含在中间相和/或有机相中。本专利技术基于以下发现:如果在最终分相前添加至少一种阳离子去污剂，可显著降低含RNA水相中的DNA含量。添加至少一种阳离子去污剂具有以下效果:更多的DNA从含RNA水相中移除并因此聚集在中间相和/或有机相中。因为DNA更有效地从含RNA水相中移除，所以从相应的已去除DNA的水相中分离RNA，该RNA含更少量的DNA，因而含更少量的DNA污染物。因此，本专利技术针对纯化的RNA中残留DNA污染物的这一问题提供解决方法，该方法有效、简便、而且不危害RNA品质。相反，RNA品质甚至比不添加阳离子去污剂的方法更好。另外，本专利技术所述方法经济有效，因为该方法不必使用额外的材料例如固相或酶，如DNA结合柱或DNA酶。因此，本专利技术具有显著优点。根据本专利技术的第一方面，提供一种从含RNA和DNA的样品中至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.06 EP 10009219.61.一种从含RNA和DNA的样品中至少分离RNA的方法，所述方法包括: a)向样品中加入包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物； b)加入不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA和蛋白质聚集于所述有机相和/或中间相；以及 c)从所述水相分离所述RNA， 其中在最终分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种阳离子去污剂具有以下一种或多种特性: a)包含带有永久性电荷的季铵阳离子； b)包含溴化铵并/或 c)选自下组:CTAB、TTAB和 DTRB。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少一种阳离子去污剂以溶液的形式添加。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶液具有一种或多种以下特性: a)所包含的至少一种阳离子去污剂的浓度选自下组:0.1%至10%、0.1%至5%、0.1%至3% 和 0.l%tol% ;和 / 或 b)包含盐，所述盐优选选自下组:氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、硝酸钠、氯化锂、硫酸铵、硫酸钠、硫酸锂、硫酸钾及其组合。5.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中通过将混合物在较低温度下离心来形成多相混合物，所述温度选自下组15° C的温度、<10° C的温度、彡7C的温度、彡5° C的温度和彡4° C的温度。6.如权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于，通过向所述水相中添加至少一种醇来分离水相中所述的RNA。7.如权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于，将所述水相与醇混合并将所述的混合物与核酸结合固定相接触来结合RNA。8.如权利要求1至7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述醇选自下组:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇和/或以选自下组的浓度添加:至少20 %、至少30 % v/v、至少40 %v/v、至少 50% v/v 和至少 60% v/vo9.如权利要求1至7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述包含离...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·克里斯托夫，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：
国别省市：