一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法技术

本发明专利技术提出了一种大规模PCR快速制备线性DNA的方法，它是在中国专利（ZL201010229160.5）低成本获得高特性DNA聚合酶RKOD的基础上，利用优化的PCR程序建立了高于常规PCR体积50-1200倍的大规模PCR方法，利用本发明专利技术获得PCR产物的浓度可达300μg/mL。在该发明专利技术中，PCR体系中的dNTPs、引物和PCRbuffer参照常规PCR浓度加样，质粒模板的浓度为1μg/mL，DNA聚合酶的用量为10U/mL，大规模PCR步骤为：(1)将反应体系置于98℃水浴0.5min；(2)72℃水浴1min；(3)将步骤(1)(2)进行40个循环，回收PCR产物。利用本发明专利技术能够实现线性DNA低成本、高速率、大规模的生产，可为进一步低成本、高效快速制备线性DNA疫苗应对新发传染病奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大规模PCR (polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)低成本、高速率制备线性DNA的方法，属于工业微生物应用领域。
技术介绍
PCR (polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)是 Kary B.Mullis (NobelLaureate for procedure to replicate DNA, science, 1985)首次专利技术的体外扩增线性DNA的技术，是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一。PCR模拟于DNA的自然复制过程，它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火、延伸等一次循环，DNA链的数量增加一倍，模板在以后进行的循环，新合成的DNA可再次成为模板。如此循环一次，DNA拷贝数便增加一倍。经多次循环，可以将目的DNA的量扩增IO6-1O7倍。PCR技术因其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等特点而广泛应用于分子生物学、免疫学、医学等领域。最近本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤为：1）利用专利ZL201010229160.5制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，制备耐高温特性DNA聚合酶RKOD；所述的LBMMY培养基配方：2%Tryptone，1%Yeast?Extract，0.34%YNB，1%（NH4）2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0，1%甘油；2）根据待扩增目的靶基因序列，利用Genetool?分析软件按照碱基互补配对的原则设计获得目的基因两端20?50nt的正反向引物序列，并用化学方法合成；3）按下表配制大小不同反应体系总体系50μL5mL20mL60mL120mL...

【技术特征摘要】
1.一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤为: 1)利用专利ZL201010229160.5制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，制备耐高温特性DNA聚合酶RKOD ； 所述的 LBMMY 培养基配方:2%Tryptone, l%Yeast Extract,0.34%YNB, 1% (NH4) 2S04,lOOmmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0,1%甘油； 2)根据待扩增目的靶基因序列，利用Genetool分析软件按照碱基互补配对的原则设计获得目的基因两端20-50nt的正反向引物序列，并用化学方法合成； 3)按下表配制大小不同反应体系2.按照权利要求1所述一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤2)为:待扩增目的靶基因序列是流感病毒HINl的HA基因，利用Geneto...

【专利技术属性】
技术研发人员：余晓岚，马立新，卞璐，廖峰，金梅林，王飞，赵慧，陈全娇，
申请(专利权)人：湖北大学，北京伟嘉人生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：