一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法技术

本发明专利技术属于遗传工程技术领域。公开了一种高山植物长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法。该方法首次将CTAB法与SDS法相结合提取纯化长白山牛皮杜鹃基因组DNA，并且提取方法中，CTAB提取缓冲液中的PVP用量为4%，较常规方法增加了2%；?-巯基乙醇用量为4.3%，较常规方法增加了约1倍；65℃温浴时间由常规方法的1小时延长至4小时；并结合SDS法纯化所提取的基因组，成功地提取出了纯度高、质量好的长白山牛皮杜鹃基因组DNA。本发明专利技术克服了现有高山植物基因组提取困难、提取的基因组纯度低、易降解的不足，对于后续的分子水平研究及高山植物基因组的研究均具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高山植物基因组DNA提取的方法，属于基因工程
，具体的说涉及一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法。
技术介绍
由于高山植物环境条件恶劣，所以高山植物通常被认为是陆地上最为极端的生物，但是高山植物却也拥有丰富极具价值的基因资源。自1896年以来，作为生物进化研究中的热点和难点，高山和极地植物对生境的适应机制和策略一直倍受研究者们的关注。高山植物基因组DNA的提取技术是进行植物分子生物学研究的基本技术之一，DNA产率的高低，质量的好坏直接影响到后续实验的成败。探讨高山植物基因组DNA的提取方法是一项非常有意义的工作，为确保在农作物环境胁迫抗性育种方面提供优异种质和选择指标、为农业基础研究与基因工程提供相关基因。将这种特殊的基因资源应用在观赏陆地植物，将保护与合理利用有效结合，走人与自然和谐发展的可持续性发展道路，这不仅有利于该区域植被的生长发育、生态系统的稳定，更有利于地区经济的发展。高山植物的基因组提取方法有多种，近年来，人们一直致力于研究一种高效快速的提取方法，但是由于物种的特异性，高山植物的基因组提取起来并不是那么方便，。高山植物生存的环境温度低，辐射强，在这样的环境中，植物生长极其缓慢，产物消耗减少，为提高其抵御寒冷和生理干旱方面，使部分糖分和脂类物质积累并储存于叶片组织细胞中，使得高山植物基因组DNA的提取难度加大。王卓伟，等在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVP还能有效地去除多糖。罗志勇等在研究中对这种方法进行了几点改进:①提高CTAB的浓度；②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中β_巯基乙醇的含量，同时加入PVP使其与多酚类物质结合形成复合物；③增加低盐沉淀缓冲液的量；④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA;Porebski,等在沉淀粗提DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5 mol.Γ1以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，`可更有效地除去多糖。余志雄对火龙果总DNA提取方法比较研究验证了 CTAB法对火龙果基因组提取是有效，而且应雄美对两种不同甘蔗基因组DNA提取方法的比较，同时证明了 SDS和CTAB法都能提取到基因组DNA并且对两种方法进行了改进。长白山杜鹃是一种有代表性高山植物，在海拔1700 m-2500 m海拔带均有分布，其生理生化指标较为特殊，关于本研究中提到的长白山杜ill基因组提取的方案也有多种，但是不同方法对不同植物的基因组提取效果大不相同。对于杜鹃的基因组DNA提取方面的研究还是很少的。赵喜华，等以杜鹃属常绿杜鹃亚属井冈山杜鹃树叶为材料分别采用CTAB法、碱裂解法、SDS法提取杜鹃基因组DNA，三种方法所提取的DNA纯度及产率有差别，其中CTAB法较好。庄得凤，曹后男，采用CTAB法(①取0.2 g左右研磨好的新鲜叶片置于1.5mL 离心管中，加 800 ul 经 65°C预热的 CTAB ( 2% CTAB; 100 mmol.Γ 1 Tris -HCl，pH8.0 ；20 mmol.17 1 EDTA ；1.4 mol.17 1 NaCl ；2% PVP )提取缓冲液，研磨前加入 2%β-巯基乙醇；充分混匀后，在水浴锅中65°C温浴Ih ;等)提取几个品种长白山杜鹃的基因组DNA，所得的DNA纯度高、质量好，但是牛皮杜鹃及孢叶杜鹃基因组未能提取出来。本实验用SDS法提取植物基因组(魏群.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社，2007.)的方法:“取0.2g新鲜植物叶片，在液氮中研磨成粉末状；转移至2 mL离心管中，加入 800 ul 细胞提取液(pH 8.0,100 mmol.I/1 Tris.HCl, 5 mmol.L-1 EDTA, 500mmol.Γ1 NaCl,1.25% SDS, 100 ul β-巯基乙醇)，充分混匀；65°C水浴保温20分钟；从水浴中取出离心管，加入250 ul 5 mol -T1 KCl溶液，混匀，冰浴20分钟；等”来提取长白山杜鹃的基因组，未能成功提取出其基因组DNA。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的在于克服现有技术对长白山杜鹃基因组DNA提取方法中，基因组提取困难、纯度低、易降解的不足，提供一种新的长白山杜鹃基因组DNA提取的方法，从而获得纯度高、稳定性强的长白山杜鹃基因组DNA。本专利技术是按以下技术方案实现的:该方法采用CTAB法与SDS法相结合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鹃基因组，然后再采用SDS法纯化所提取的牛皮杜鹃基因组DNA。该方法的具体步骤如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA: 向提取容器内加入CTAB提取缓冲液，预热至65 V ;将牛皮杜鹃新鲜叶片在研磨前加入B-巯基乙醇，加入量为CTAB提取缓冲液体积的4.3%V/V，经液氮研磨成冻粉状后迅速加入到上述预热的CTAB提取缓冲液中，充分混匀；于65 °C温浴4小时；然后按常规方法提取出基因组DNA ； (2)、结合SDS法纯化所提取的基因组DNA: 向上述CTAB法提取出的牛皮杜鹃基因组DNA溶液中加入1/10体积(SDS体积:基因组DNA溶液体积=1:10) 2%的SDS，冰浴10分钟；加入1/10体积5 mol.I/1 KAc，冰浴30分钟；18 1:下12，000 rpm离心10分钟，取上清液；加入1/20体积2%的SDS，冰浴10分钟；加入1/20体积5 mol.Γ1 KAc，冰浴30分钟；离心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗涤沉淀，溶解沉淀即为纯化的牛皮杜鹃基因组DNA。所述的CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA的具体步骤如下: 取2.0 ml离心管，加入700 ul的CTAB提取缓冲液，65 °C预热；取新鲜幼嫩牛皮杜鹃材料0.3 g，研磨前加入30 ul β_巯基乙醇，液氮中研磨成冻粉末状并迅速将该冻粉转入上述离心管中，充分混匀；水浴中65 °C温浴4小时；然后按常规方法提取出牛皮杜鹃基因组DNA粗品； 所述的结合SDS法纯化所提取的基因组的具体步骤如下: 向上述CTAB法提取出的牛皮杜鹃基因组DNA溶液中加入1/10体积2% 的SDS，冰浴10分钟；加入1/10体积5 mol.Γ1 KAc，冰浴30分钟；18 1:下12，000 rpm离心10分钟，取上清液；加入1/20体积2%的SDS，冰浴10分钟；加入1/20体积5 mol吨―1 KAcJjC浴30分钟；离心，取上清 液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗涤沉淀，溶解沉淀即为纯化的牛皮杜鹃基因组DNA。以上牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法中，所述的CTAB提取缓冲液是由:2% CTAB,100 mmol.L-1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol.L-1 EDTA,1.4 mol.L-1 NaCl，4% PVP 组成；所述的酚氯仿是苯酚与氯仿按1:1体积比配制而成。本专利技术具有以下有益的效果:1、本专利技术的牛皮杜鹃基因组提取方法中，首次采取了 CTAB法与SDS法结合，即CTAB法提取基因组之后，结合SDS法纯化所提取的基因组。2、本专利技术的方法对现有的CTAB法和SDS法进行了有创造性的改进，具有突出的实质性特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法，其特征在于：该方法采用CTAB法与SDS法相结合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA，然后再采用SDS法纯化所提取的基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法，其特征在于:该方法采用CTAB法与SDS法相结合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA，然后再采用SDS法纯化所提取的基因组DNA。2.—种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法，其特征在于:该方法的具体步骤如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA: 向提取容器内加入CTAB提取缓冲液预热至65 V ;将牛皮杜鹃新鲜叶片在研磨前加入β-巯基乙醇，加入量为CTAB提取缓冲液体积的4.3%V/V，经液氮研磨成冻粉状后迅速加入到上述预热的CTAB提取缓冲液中，充分混匀；于65 °C温浴4小时；然后按常规方法提取出牛皮杜鹃基因组DNA ； (2)、结合SDS法纯化所提取的基因组DNA: 向上述提取出的牛皮杜鹃基因组DNA溶液中加入1/10体积2%的SDS’冰浴10分钟；加入1/10体积5 mo I.Γ1 KAc，冰浴30分钟；18 1:下12，000 rpm离心10分钟，取上清液；加入1/20体积2%的SDS，冰浴10分钟；加入1/20体积5 mol.L—1 KAc，冰浴30分钟；离心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗涤沉淀，溶解沉淀即为纯化的牛皮杜鹃基因组DNA。3.根据权利要求2所述的一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪伟，周晓馥，未晓巍，
申请(专利权)人：吉林师范大学，
类型：发明
国别省市：