本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的５’－核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定５’－核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶（脱羧化）及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的速度，从而测算出５’－核苷酸酶的活性浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种5，-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本专利技术还涉及测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定
背景4支术医学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可 见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化 和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升 高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无生理性升高，对于 诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特 异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测 磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法， 方法为5，-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱 分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺 苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5'-核苷酸 酶的活性。同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因 此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年专利技术的方法，准确度不好， 强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测4定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的 5'-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行5，-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准 确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术5'-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下核苷单磷酸+水5核苷酸酶核苷+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)L-苹果酸+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等 这种方法应用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、苹 果酸脱氢酶(脱羧化)(malatedehydrogenase(decarboxylation); EC 1丄1.38; EC 1丄1.39;EC 1丄1.40;EC 1丄1.83)酶促反应连续监测法。5，-核苷酸酶酶 解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)的作用，最终将还te型辅酶(在340nm处有吸 收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辨 酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度， 可以测算5'-核苷酸酶的活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术5'-核苷酸酶诊断试剂 较为理想缓冲液 100mmol/L稳定剂 还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化f苹果酸脱氢酶(脱羧化)核苷单磷酸草酰乙酸丙酮酸500誦ol/L 0.25 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L本专利技术的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸 脱氢酶(脱羧化)、核苷单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶(脱 羧化)。还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)、核苷 单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶(脱羧化)。试剂3缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)、核苷 单磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定5，-核苷酸酶活性浓度的方法， 其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂， 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂还原型辅酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化 苹果酸脱氢酶(脱羧化)核苷单磷酸草酰乙酸丙酮酸包括100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 10000U/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5，-核苷酸酶样 品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核苷酸酶的 活性浓度大小。 实施例二本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 核苷单磷酸 草酰乙酸 丙酮酸10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶苹果酸脱氢酶(脱羧化) 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光画mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 10000U/L度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405mn，被测5，-核苷酸酶样 品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核苷酸酶的 活性浓度大小。 实施例三本实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的５’－核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下： 核苷单磷酸＋水 ５核苷酸酶 核苷＋磷酸根 磷酸根＋草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳＋磷酸烯醇式丙酮酸＋水 二氧化碳＋丙酮酸＋ 还原型辅酶 苹果酸脱氢酶（脱羧化） Ｌ－苹果酸＋辅酶 核苷单磷酸可以是：腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出５’－核苷酸 酶的活性浓度大小结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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