腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、腺苷、５’－核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本专利技术还涉及测定腺苷脱 氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定

技术介绍
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核 酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SC工D)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鉴别的重要诊断标志。腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H20 )腺苷脱氨酶肌苷(Inosine ) +氨离子(NH/),此反 映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸 光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院 的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广 应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺 苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的腺苷脱 氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动4生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本专利技术腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子 肌苷+磷酸根 5'-核苷酸酶肌苷单磷酸+水 肌苷单磷酸+辅酶次黄苷单磷酸脱氢酶黄苷单磷酸+还原型辅酶这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)联5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC 3丄3.5)、次黄苷单磷酸脱氢酶(Inosine 5-phosphate dehydrogenase; EC1丄1.205)酶促反应连续监测法。腺苷脱氨酶 酶解腺苷反应产生肌苷，再通过(偶)联合5'-核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢 酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速 度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算腺苷脱氨酶酶的活性浓 度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术腺苷脱氨酶诊断试剂较为 理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L5'-核苷酸酶 6000 U/L次黄苷单磷酸脱氢酶 12000 U/L腺苷 8 mmol/L缓冲液最好使用磷酸缓冲液，否则需要在试剂中添加磷酸盐。本专利技术的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、5'-核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢酶、腺苷。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷。试剂2缓冲液、稳定剂、5'-核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢酶。 辅酶、5'-核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢酶、腺苷在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷。 试剂2缓冲液、稳定剂、次黄苷单磷酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、5'-核苷酸酶。辅酶、5'-核苷酸酶、次黄苷单磷酸脱氢酶、腺苷在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，其 辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括磷酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 500 mmol/L辅酉每 3 mmol/L5'-核苷酸酶 6000 U/L次黄苷单磷酸脱氢酶 10000 U/L腺苷 8 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左 右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。实施例二本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括试剂1磷酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L腺苷 8 mmol/L试剂2磷酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L5'-核苷酸酶 6000 U/L次黄苷单磷酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。;施例三本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括:试剂1磷酸缓冲液 稳定剂 辅酶 腺苷试剂2磷酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L次黄苷单磷酸脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L试剂磷酸缓冲液稳定剂5'-核苷酸酶100mmol/L500 mmol/L6000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反 应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右， 理论K值2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上
技术实现思路
中记载的其他测定方法均能达 到本专利技术的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明采用本专利技术的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：　腺苷＋水　腺苷脱氨酶　肌苷＋氨离子　肌苷＋磷酸根　５’－核苷酸酶　肌苷单磷酸＋水　肌苷单磷酸＋辅酶　次黄苷单磷酸脱氢酶　黄苷单磷酸＋还 原型辅酶　将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]