浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体技术

提供由广泛的动物物种高效率地制作抗原特异性单克隆抗体的技术，利用该技术提供新的抗原特异性单克隆抗体。用靶抗原对非人动物进行免疫，从免疫成立后的非人动物中采集淋巴液等，或者，从具有抗靶抗原抗体的人采集淋巴液等，将采集的淋巴液等和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合，选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。根据上述方法，选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞，从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因，鉴定其核苷酸序列，根据鉴定的基因的核苷酸序列制备所述抗体或抗体片段，并制备靶抗原特异性抗体或抗体片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体相关申请的相互参照本申请主张于2011年3月30日申请的日本特愿2011－075135号的优先权，其全部内容作为公开而特别引用于此。
本专利技术涉及浆细胞或成浆细胞的选择方法、靶抗原特异性抗体的制备方法、新的单克隆抗体。更详细而言，本专利技术涉及与靶抗原特异性结合的浆细胞或成浆细胞的选择方法、使用利用该方法得到的浆细胞或成浆细胞制备靶抗原特异性抗体的方法、以及利用该抗体制备方法新得到的新的单克隆抗体。
技术介绍
目前，抗体药品开发中使用的单克隆抗体，大多是将小鼠抗体人源化而得到的抗体。其原因在于，作为单克隆抗体制作方法，确立了小鼠杂交瘤法。但是，对于作为抗体药物的靶标的人蛋白的功能性抗原表位中的多数，人-小鼠间的氨基酸序列同源性高，即使用这样的抗原对小鼠进行免疫，由于免疫耐受，也难以得到特异性高的抗体。因此，必须制作数量巨大的杂交瘤并进行筛选，直至获得具有高能力的抗体。于是，为了开发新的抗体药品，人们对尽可能与人的抗原具有不同的氨基酸序列的动物物种进行免疫，回避免疫耐受的限制，从而寻求用于高效率地生产具有高能力的单克隆抗体的方法。以往的单克隆抗体制作广泛采用下述方法：通过使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，制作具有自主增殖能力的杂交瘤，再从中筛选具有产生具备靶标特异性的抗体的能力的克隆。但是，杂交瘤方法存在几个缺点。其中一个缺点是，由于杂交瘤技术是限于小鼠抗体产生细胞的方法，所以难以在其他动物物种中应用。而且，杂交瘤的筛选费时费事，这也是缺点。另外，即使进行筛选，也无法保证得到具有抗原特异性抗体产生能力的克隆，这也是个问题。为了克服上述缺点，在人单克隆抗体的制作中，开发了应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)的具有抗原特异性抗体产生能力的浆细胞(抗原特异性浆细胞)的鉴定法(日本特开2009－34047号公报：专利文献1(WO2009/017226、US2011/0294678A1)(它们的全部内容作为公开而特别引用于此))。该方法是将由人淋巴细胞纯化的浆细胞放入实施了特殊加工的微孔中，将由浆细胞大量分泌的抗体固定在浆细胞周围的底座上，使标记抗原与其反应，从而进行抗原特异性浆细胞的鉴定。
技术实现思路
但是，在上述专利文献1记载的方法中，抗原特异性浆细胞的鉴定需要特殊的装置，细胞的回收也需要非常繁杂的操作。而且，在该方法中，必须进行使用细胞表面抗原的浆细胞的纯化操作，所以无法由尚未确立浆细胞鉴定法的动物物种制作抗原特异性单克隆抗体。因此，本专利技术的目的在于：克服上述缺点，提供由广泛的动物物种高效率地制作抗原特异性单克隆抗体的技术。而且，本专利技术的目的还在于：利用上述新开发的制作抗原特异性单克隆抗体的技术，提供新的抗原特异性单克隆抗体。B细胞在细胞膜上表达抗体(膜型抗体)，抗原与其结合，从而引起免疫球蛋白基因的类别转换和体细胞高频率突变，其结果，选出与抗原的亲和性增强的B细胞。该高亲和性B细胞中的一部分分化成浆细胞，成为抗体产生细胞。已知随着该分化，浆细胞通过免疫球蛋白基因的选择性剪接使膜型抗体的表达消失，使分泌型抗体大量表达(ImmunologicalReviews，SarahA.Oracki,JenniferA.Walker,MargaretL.Hibbs,LynnM.Corcoran,DavidM.Tarlinton，SpecialIssue:B-LymphocyteBiology，第237卷,第1期,第140-159页,September2010:非专利文献2(其全部内容作为公开而特别引用于此))。在进行大鼠、豚鼠、兔的浆细胞分析的过程中，专利技术人新发现了：在由这些动物得到的浆细胞表面，有能够进行抗原结合分析的量的膜型抗体分子在表达。由此认为：通过使标记抗原与在浆细胞表面表达的高亲和性膜型抗体直接结合，有可能可以鉴定抗原特异性浆细胞。但是，在浆细胞膜上表达的抗体分子的量少，因此即使存在与标记抗原特异性结合的浆细胞，由于标记抗原的非特异性吸附而产生的噪音，也难以鉴定抗原特异性浆细胞。作为通过使用内质网特异性荧光色素来高效率地鉴定浆细胞的方法，专利技术人开发了“浆细胞鉴定和分离用荧光探针以及使用该探针的浆细胞的鉴定或分离方法”，并申请了专利[WO2011/118579(其全部内容作为公开而特别引用于此)]。专利技术人发现：利用只是使荧光标记抗原和内质网亲和性荧光色素与由免疫动物制备的细胞悬浮溶液作用的单纯的操作，可以鉴定抗原特异性浆细胞，完成了本专利技术。本专利技术如下。[1]选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法，该方法包括：从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，或者，用靶抗原对非人动物进行免疫，从免疫成立后的非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合，选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。[2]选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法，该方法包括：从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，或者，从具有抗靶抗原抗体的人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合，选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。[3]靶抗原特异性抗体或抗体片段的制备方法，该方法包括：利用权利要求1或2所述的方法选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种细胞，从选择的细胞中采集抗靶抗原抗体基因，鉴定其核苷酸序列，根据鉴定的基因的核苷酸序列，制备上述抗体或抗体片段。[4]权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是用于浆细胞和/或成浆细胞的鉴定或分离的荧光探针，该荧光探针对细胞内质网的染色选择性高于其对内质网以外的细胞器的染色选择性，通过利用该荧光探针进行的染色，可以识别浆细胞和成浆细胞与浆细胞和成浆细胞以外的细胞。[5]权利要求4所述的方法，其中，上述荧光探针选自(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质、以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质。[6]权利要求5所述的方法，其中，上述两亲性的两亲性指数(AI)为+6>AI>0，中等程度的脂溶性的疏水性指数(logP)为+6>logP>0，一定以上的亲和性的解离常数为0.1µM～0.1nM的范围。[7]权利要求4～6中任一项所述的方法，其中，上述内质网以外的细胞器是质膜、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、核、中心体、细胞质基质、吞噬体、核内体或聚集体。[8]权利要求4～7中任一项所述的方法，其中，上述荧光探针选自荧光标记格列本脲、荧光标记布雷菲德菌素A、荧光探针和荧光蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法，该方法包括：从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，或者，用靶抗原对非人动物进行免疫；从免疫成立后的非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞；将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合；以及选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.30 JP 2011-0751351.选择与靶抗原特异性结合的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法，该方法包括：从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，或者，用靶抗原对非人动物进行免疫；从免疫成立后的非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞；将上述致敏的或采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞和(1)标记的靶抗原以及(2)选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质混合；以及选择上述(1)标记的靶抗原和(2)标记物质所结合的细胞，此时，选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质是对细胞内质网的染色选择性高于对内质网以外的细胞器或细胞质基质的染色选择性的荧光探针，上述选择性地与浆细胞和/或成浆细胞结合的标记物质选自：(1)两亲性、阳离子型且具有中等程度的脂溶性的物质；以及(2)对显示出内质网分布的蛋白具有一定以上的亲和性的物质，上述两亲性的两亲性指数(AI)为+6>AI>0，中等程度的脂溶性的疏水性指数(logP)为+6>logP>0，一定以上的亲和性的解离常数为0.1nM～0.1µM的范围。2.选择与靶抗原特异性结合的人的浆细胞和成浆细胞中的至少一种的方法，该方法包括：从人中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，在体外用靶抗原致敏所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓的细胞，或者，从具有抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：黑泽信幸，矶部正治，
申请(专利权)人：国立大学法人富山大学，
类型：
国别省市：