高效的肝炎病毒的抗体诱导方法、抗体以及检测系统技术方案

本发明专利技术的课题在于提供能够识别乙型肝炎病毒(HBV)的大球形颗粒中附加糖链的抗原的检查系统、识别附加糖链的抗原并表现出抑制感染效果的中和抗体。明确了大球形颗粒与特定的糖链结构相关，由此能够构建具有感染性的即包含核酸的乙型肝炎病毒颗粒的新的检测系统，能够提供识别附加糖链的抗原并表现出抑制感染效果的中和抗体。果的中和抗体。果的中和抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高效的肝炎病毒的抗体诱导方法、抗体以及检测系统


[0001]本专利技术涉及乙型肝炎病毒抗原及其制造方法、含有乙型肝炎病毒抗原的疫苗用组合物、抗乙型肝炎病毒抗体和编码其抗体的核酸、乙型肝炎病毒的检测系统、以及乙型肝炎病毒用药物组合物。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒，具有不完全双链DNA，是特异性感染人肝脏的病毒。由于HBV的感染，有可能发展成乙型急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌，是重大的健康问题之一。认为目前日本有人口的约1％(约110-140万人)的乙型肝炎病毒(HBV)持有者，全世界约有5％(3亿5千万人)的感染者(WHO报告)。
[0003]使用基于干扰素(抗病毒药)的免疫疗法和核酸类似物(逆转录酶抑制剂)进行乙型肝炎的治疗，但已指出副作用、耐药病毒的产生等问题，期待针对新靶的新治疗药。
[0004]另一方面，为了防止HBV感染的扩散，疫苗的接种是有效的。目前，尽管世界各国和各地区对HBV实施了常规疫苗接种，但在日本直到最近也没有进行常规疫苗接种，因此认为很难防止新的HBV感染的发生。目前，使用酵母制备的疫苗(重组S-HBs抗原)，但均作为没有附加糖链的蛋白质使用。
[0005]为了引起疫苗接种后抗体效价的上升，需要接种多次(3次)以上，根据以往的疫苗，约有近90％的接种者获得抗体。但是，得到的抗体效价存在很大的个人差异。为了抑制常规疫苗接种的经费，也需要改善这些抗体诱导效率的问题。另一方面，最近的报告报道了即使HBV疫苗能够防止乙型肝炎的发病，也不能防止HBV感染的事例。另外，报告了通过HBV疫苗接种诱导的抗体无法识别的逃逸变异、隐匿性感染，重要的是开发也能够与这些变异HBV对应的新一代HBV疫苗(例如接种次数少也有效，有更广泛的抗病毒效果的疫苗)、抗HBV抗体。
[0006]在HBV感染者的血液中，存在具有感染性的HBV颗粒(大球形颗粒(Dane颗粒))和无感染性的空颗粒(SVP)。具有感染性的大球形颗粒在核(HBc)中含有DNA，还具有被包膜(HBs)包围的结构，但无感染性的空颗粒(SVP)仅为HBs，不含有DNA(图1)。
[0007]HBs基因由PreS1、PreS2、S构成，编码从不同的翻译起始蛋氨酸密码子开始的3种膜蛋白(L-HBs抗原、M-HBs抗原、S-HBs抗原)。根据这些不同的HBs抗原的构成的不同，形成上述HBV颗粒(大球形颗粒和SVP)。以往的疫苗是作为抗原在酵母中表达的无糖链的S-HBs抗原(S(-Gly))，不含有实际的HBV颗粒中含有的具有糖链的L、M、S(+Gly)糖蛋白。表明了SVP以大球形颗粒的一千倍以上存在于患者血清中，认为现有的HBV疫苗识别的HBV以没有感染性的SVP为主。
[0008]HBV是一种感染能力非常高的病毒，尽管感染性大球形颗粒的比例与没有感染性的SVP相比仅存在1/1000左右。为了准确地测定HBV颗粒(大球形颗粒)或提高HBV的检出限，一种方法是将具有感染性的大球形颗粒浓缩。另外，为了高效地制备诱导抗体的疫苗，重要的是选定能够区分大球形颗粒和无感染性的小颗粒(SVP)的靶(抗原)。
[0009]另外，献血的安全性通过实施根据核酸检查(NAT)的筛选来确保，但HBV在检出限以下的低拷贝下感染成立，因此，与HCV、HIV相比，输血引起的感染事故不断发生。即，浓缩大球形颗粒的技术对于提高HBV检测的精度是不可或缺的。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：国际公开第2016/167369号小册子。
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献1：Ito K et al.J Virol.2010Dec；84(24)：12850-61。

技术实现思路

[0015]专利技术要解决的课题
[0016]本专利技术的目的在于，提供用于获得不能识别乙型肝炎病毒(HBV)的空颗粒而能够识别大球形颗粒的检查系统、或者能作为能够诱导不能识别空颗粒而能够识别大球形颗粒的抗体的产生的疫苗使用的乙型肝炎病毒抗原、不能识别空颗粒而识别大球形颗粒并表现出抑制感染效果的中和抗体，以能够广泛地涵盖目前要求解决的上述事例的技术和生成物。
[0017]用于解决课题的手段
[0018]本专利技术人等明确了大球形颗粒与特定的糖链结构相关。由此，成功地构建了具有感染性的即含有核酸的乙型肝炎病毒颗粒的新型检测系统。
[0019]即，本発明涉及以下的(1)～(21)和[1]～[21]。
[0020](1)一种使用抗体的诱导和抗体及凝集素的筛选方法，其用于区分乙型肝炎病毒中具有感染性的HBV颗粒(大球形颗粒)和无感染性的空颗粒(SVP)。
[0021](2)一种具有糖链的乙型肝炎病毒抗原，其用于上述使用抗体的诱导和抗体及凝集素的筛选方法。
[0022](3)一种乙型肝炎病毒抗原，其用于上述方法，在由从由PreS1、PreS2以及S区域组成的组中选出的基因编码的HBs糖蛋白中具有糖链。
[0023](4)一种来自HBs糖蛋白的乙型肝炎病毒抗原，其具有下述式[1]、[2]或[3]的结构。
[0024]化学式1
[0025][0026]化学式2
[0027][0028]化学式3
[0029][0030](5)一种乙型肝炎病毒抗原，在上述式[1]、[2]或[3]中，氨基酸序列的同源性为70％以上。
[0031](6)一种乙型肝炎病毒抗原，在上述式[1]、[2]或[3]中，1～3个残基的氨基酸残基被附加、缺失和/或置换。
[0032](7)一种乙型肝炎病毒抗原，在上述式[1]、[2]或[3]的连续的Thr(PTTA中的TT)的一方和/或双方中，附加的糖链结构被NeuAcα2-6置换，Galβ1-3GalNAc、仅GalNAc和1～2个糖的糖链被附加、缺失和/或置换。
[0033](8)如(2)～(7)中任一项所述的乙型肝炎病毒抗原的制造方法，其中，使用糖链合成技术。
[0034](9)如(8)所述的制造方法，其中，糖链合成技术是利用酵母的生物合成、化学合成、酶合成或它们中的2种以上的组合。
[0035](10)一种疫苗用组合物，其含有(2)～(7)中任一项所述的乙型肝炎病毒抗原或通过(8)或(9)的制造方法制造的乙型肝炎病毒抗原。
[0036](11)一种识别(2)～(7)中任一项所述的乙型肝炎病毒抗原、或者通过(8)或(9)的制造方法制造的乙型肝炎病毒抗原的抗体、噬菌体抗体。
[0037](12)如(11)所述的抗体，其为小鼠抗体、大鼠抗体、羊驼抗体、马抗体、猴抗体、兔抗体、山羊抗体、绵羊抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体(scFv)或嵌合抗体。
[0038](13)一种具有由序列号1或2表示的碱基序列的编码抗乙型肝炎病毒抗原抗体基因的核酸。
[0039](14)一种与由序列号1或2表示的碱基序列具有70％以上的同源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种乙型肝炎病毒抗原，其中，其具有在PreS1、PreS2和S区域的氨基酸序列(序列号14)中在包括位置15、123和/或320的氨基酸Asn、和/或位置156和/或157的氨基酸Thr的连续的至少13个氨基酸序列或者上述连续的至少13个氨基酸序列中附加、缺失和/或置换1～3个残基的氨基酸残基的氨基酸序列，并且具有在位置15、123和/或320的氨基酸Asn上附加的N结合型糖链、和/或在位置156和/或157的氨基酸Thr上附加的O结合型糖链，所述O结合型糖链包括附加在所述氨基酸Thr上的GalNAc。2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原，其中，所述乙型肝炎病毒抗原具有序列号15所示的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的乙型肝炎病毒抗原，其中，O结合型糖链为NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc。4.如权利要求1或2所述的乙型肝炎病毒抗原，其中，所述O结合型糖链为，(1)NeuAcα2-6Galβ1-3GalNAc、(2)Galβ1-3GalNAc、(3)GalNAc、或者(4)在(1)～(3)上附加、缺失和/或置换1～2个糖的糖链。5.一种疫苗用组合物，其中，其含有权利要求1～4中任一项所述的乙型肝炎病毒抗原。6.一种抗乙型肝炎病毒抗原抗体，其中，其与权利要求1～4中任一项所述的乙型肝炎病毒抗原特...

【专利技术属性】
技术研发人员：成松久，安形清彦，梶裕之，久野敦，佐藤隆，千叶靖典，栂谷内晶，清水弘树，曾我部万纪，我妻孝则，沟上雅史，是永匡绍，田尻和人，小泽龙彦，
申请(专利权)人：国立大学法人富山大学，
类型：发明
国别省市：