本发明专利技术提供无需利用细胞表面标记物，可以高效率、高纯度地由哺乳类或鸟类分离浆细胞和浆母细胞的方法。荧光探针，与对内质网以外的细胞器的染色选择性相比，其对细胞的内质网的染色选择性高。涉及鉴定浆细胞和浆母细胞的方法，该方法包括：使用该荧光探针，对来自淋巴结组织等的细胞进行染色，根据来自染色的细胞的荧光强度来鉴定浆细胞和浆母细胞。荧光探针，与对细胞核以外的细胞器的染色选择性相比，其对细胞核的染色选择性高。鉴定淋巴结组织等中的浆细胞和浆母细胞的方法，该方法包括：使用该荧光探针，对来自淋巴结组织等的细胞染色，根据来自染色的细胞的荧光强度来鉴定浆细胞和浆母细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及浆细胞和浆母细胞的鉴定和分离用荧光探针以及使用该探针的浆细胞和浆母细胞的鉴定或分离方法。
技术介绍
抗体通过与靶抗原特异性结合，在生物体防御中发挥重要的作用。近年来，利用抗 体对抗原的特异性结合性的抗体药物是作为自身免疫疾病或癌症等疑难病的治疗药开发，其有用性得到很高评价。近年来，对于可制成这样的抗体药物的、高特异性·高亲和性单克隆抗体的高效制作技术的开发需求日益增高，因此，正在建立使用基因克隆法，由人和小鼠的抗体生成细胞制作抗原特异性单克隆抗体的方法。该方法主要包含以下3个步骤(I)由完成了免疫的动物的末梢血、淋巴组织分离抗体生成细胞，(2)由抗体生成细胞克隆免疫球蛋白基因，(3)通过免疫球蛋白基因导入宿主细胞来生成抗体。为了采用本技术高效率地制作单克隆抗体，首先必须高纯度地分离抗体生成细胞。抗体生成细胞通常采用B淋巴细胞或其最终分化而成的浆细胞和浆母细胞。浆细胞和浆母细胞是B淋巴细胞最终分化所得，是为抗体生成而特化的细胞。由于已经进行了被称为亲和力成熟的抗体基因的体细胞突变和由抗原进行的选择，因此，这些细胞对于结合能力高的抗体的分离特别有用。但是，浆细胞和浆母细胞是含有若干亚型的不均一的细胞群，在淋巴组织内的存在率低，为O. 1%以下，因此难以高纯度分离。目前，对于从末梢血或淋巴结中鉴定·分离浆细胞和浆母细胞，必须进行至少将3种以上的细胞表面标记物的抗体组合的多个阶段的正向·反向筛选操作(非专利文献I)。现有技术文献 非专利文献 非专利文献 I :Sanderson, R. D. , Lalor, P. , Bernfield, Μ. B lymphocytesexpress and lose syndecan at specific stages of differentiation: CellRegulation 1: 27-35 (1989) 非专利文献 2 :Horst，A. Hunzelmannj N. Arcej S. Herberj M. Manzj R. A.Radbruchj A. Nischtj R. Schmitz, J. Assenmacherj M. Clin. Exp. Immunol. 130:370—378 Detection and characterization of plasma cells in peripheral blood:correlation of IgE+ plasma cell frequency with IgE serum titre (2002) 非专利文献I和2的全部记载均作为特别公开引用到本说明书中。
技术实现思路
如上所述，从末梢血或淋巴结中鉴定·分离浆细胞和浆母细胞时，必须进行多个阶段的正向·反向筛选操作，因此，浆细胞和浆母细胞的鉴定·分离需要时间和繁杂的步骤。并且，使用细胞表面标记物抗体进行的浆细胞和浆母细胞的分离方法在目前阶段仅在人和小鼠中建立(非专利文献1、2)。因此，目前在采用基因克隆法制作单克隆抗体时，只使用来自人和小鼠的浆细胞和浆母细胞。但是，大部分作为抗体药物靶标的人蛋白质的功能性抗原表位在人-小鼠间的同源性高，因此，即使用其对小鼠免疫，由于免疫耐受，大多也难以获得特异性高的抗体。因此，为了避免免疫耐受的限制，作为新的抗体药物开发的目标，由使用小鼠以外的动物种类进行的免疫得到的单克隆抗体正显示其重要性。但是，由于尚未制作出兔、大鼠、绵羊、山羊、鸡等动物的抗体生成细胞表面标记物抗体，从这些动物中鉴定·分离抗体生成细胞一·浆细胞和浆母细胞的方法尚未建立。因此本专利技术的目的在于提供无需利用细胞表面标记物，可高效率、高纯度地从包括人和小鼠在内的哺乳类直至鸟类的各种动物中分离浆细胞和浆母细胞的方法。浆细胞和浆母细胞具有其它细胞中未见的以下的特征形态。(I)与蛋白质的翻译·折叠·成熟有关的细胞器一内质网异常发达，占有细胞质的大部分。(2)细胞核小型且偏于细胞的一侧存在，核内有染色体聚集，可见车轮辐状的异染色质的结构。本专利技术人认为，这些特征是浆细胞和浆母细胞由于为大量的抗体生成而特化的原因出现的形态，因此利用该形态，不管动物种类如何，均具有可分离浆细胞和浆母细胞的可能性。基于上述考虑，本专利技术人对于很多的荧光探针、对于对浆细胞和浆母细胞的选择性染色进行了筛选。结果发现，存在这样的荧光探针(荧光探针I):其对于浆细胞和浆母细胞强烈染色，而对于可能与浆细胞和浆母细胞共存的其它细胞的染色程度低，两者间所得的荧光强度比显示可识别程度的差异。进一步发现，存在这样的荧光探针(荧光探针2):其对于可能与浆细胞和浆母细胞共存的其它细胞的核强烈染色，但对于浆细胞和浆母细胞的核则亲和性低。在此基础上发现，通过使用这些荧光探针，无需使用细胞表面标记物抗体，即可高效率地从淋巴结组织或血细胞试样中鉴定浆细胞和浆母细胞，并且可以将鉴定的浆细胞和浆母细胞分离，从而完成了本专利技术。本专利技术如下所述。[I]荧光探针，该荧光探针是对细胞的内质网的染色选择性比对内质网以外的细胞器的染色选择性高的荧光探针，通过用该荧光探针染色，可识别浆细胞和浆母细胞与浆细胞和浆母细胞以外的细胞，用于浆细胞和/或浆母细胞的鉴定或分离。[2] [I]的荧光探针，该荧光探针选自(1)两亲性和阳离子性、并且具有中等程度的脂溶性的物质；以及(2)对于显示内质网定位的蛋白质具有一定以上的亲和性的物质。[3] [2]的荧光探针，其中，上述两亲性是两亲性指数(Al)为+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指数(IogP)为+6>logP>0，一定以上的亲和性是解离常数在O. ΙμΜ-O. InM的范围。[4] [1]-[3]中任一项的荧光探针，其中，上述内质网以外的细胞器是质膜、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、核、中心体、细胞质基质、吞噬体、内体或聚集体。[5] [1]-[4]中任一项的荧光探针，其中，上述荧光探针选自荧光标记格列本脲、荧光标记布雷菲德菌素A、荧光探针和荧光蛋白。[6]荧光探针，该荧光探针是对细胞核的染色选择性比对细胞核以外的细胞器的染色选择性高的荧光探针，通过用该荧光探针染色，可识别浆细胞和浆母细胞与浆细胞和浆母细胞以外的细胞，用于浆细胞和/或浆母细胞的鉴定或分离。[7] [6]的荧光探针，其中，荧光探针是对DNA具有结合性的物质。[8] [7]的荧光探针，其中，上述对DNA具有结合性的物质是如下的物质两个氮通过聚亚甲基链连接，各个氮独立形成芳环，至少一个氮具有正电荷作为季铵基。[9] [8]的荧光探针，其中，对于上述物质，两亲性指数(Al)〈8，疏水性指数(IogP)为-5〈logP(阳离子)〈0。[10] [6]-[9]中任一项的荧光探针，其中，上述荧光探针为SYTO(注册商标)59或SYTO (注册商标)24。[11] [1]-[5]中任一项的荧光探针，其中，浆细胞和浆母细胞以外的细胞为选自红细胞、血小板、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的至少一种细胞。[12] [6]-[10]中任一项的荧光探针，其中，浆细胞和浆母细胞以外的细胞是选自单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.25 JP 2010-0707301.荧光探针，所述荧光探针是对细胞的内质网的染色选择性比对内质网以外的细胞器的染色选择性高的荧光探针，通过用该荧光探针染色，可识别浆细胞和浆母细胞与浆细胞和浆母细胞以外的细胞，用于浆细胞和/或浆母细胞的鉴定或分离。2.权利要求I的荧光探针，其中，所述荧光探针选自(1)两亲性和阳离子性、并且具有中等程度的脂溶性的物质；以及(2)对于显示内质网定位的蛋白质具有一定以上的亲和性的物质。3.权利要求2的荧光探针，其中，上述两亲性是两亲性指数(Al)为+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指数(IogP)为+6>logP>0，一定以上的亲和性是解离常数在O. I μ M-ο. InM 的范围。4.权利要求1-3中任一项的荧光探针，其中，上述内质网以外的细胞器是质膜、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、核、中心体、细胞质基质、吞噬体、内体或聚集体。5.权利要求1-4中任一项的突光探针,其中，上述突光探针选自突光标记格列本脲、荧光标记布雷菲德菌素Α、荧光探针和荧光蛋白。6.荧光探针，所述荧光探针是对细胞核的染色选择性比对细胞核以外的细胞器的染色选择性高的荧光探针，通过用该荧光探针染色，可识别浆细胞和浆母细胞与浆细胞和浆母细胞以外的细胞，用于浆细胞和/或浆母细胞的鉴定或分离。7.权利要求6的荧光探针，其中，荧光探针是对DNA具有结合性的物质。8.权利要求7的荧光探针，其中，上述对DNA具有结合性的物质是如下的物质两个氮通过聚亚甲基链连接，各个氮独立形成芳环，至少一个氮具有正电荷作为季铵基。9.权利要求8的荧光探针，其中，对于上述物质，两亲性指数(Al)〈8，疏水性指数(IogP)为-5〈logP(阳离子)〈0。10.权利要求6-9中任一项的荧光探针，其中，上述荧光探针为SYTO(注册商标)59或SYTO (注册商标)24。11.权利要求1-5中任一项的荧光探针，其中，浆细胞和浆母细胞以外的细胞为选自红细胞、血小板、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的至少一种细胞。12.权利要求6-10中任一项的荧光探针，其中，浆细胞和浆母细胞以外的细胞是选自单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和...
【专利技术属性】
技术研发人员：黑泽信幸，矶部正治，
申请(专利权)人：国立大学法人富山大学，
类型：
国别省市：
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