对缺血性脑梗塞的多能干细胞的动员制造技术

一种检测方法，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA‑3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标的用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对缺血性脑梗塞的多能干细胞的动员
本专利技术涉及一种用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞的检测方法、以及在上述检测方法中所使用的试剂盒。
技术介绍
中风是人死亡的一个主要原因。在所有中风患者中，80％以上与缺血性脑梗塞有关[1]。尽管有很多研究，但是中风的治疗依然限定于在发病后4.5小时以内使用组织纤溶酶原活化因子(tPA)的血栓溶解疗法。对于慢性期的缺血性脑梗塞患者而言，仅确立了支援性照顾和康复。因此，需要一种用于改善患者的功能转换的替代治疗方法。在最近的研究中，被证实在包括缺血性脑梗塞的各种疾病中，各种干细胞/前体细胞从骨髄向外周血动员。该细胞中包括内皮前体细胞(EPC)、造血干细胞、CD31阳性细胞(血管前体细胞)等，有助于脑血管新生。另外，间充质干细胞(MSC)释放出神经营养因子等，能提高缺血性脑梗塞后的功能恢复[2]。更重要的是，这些细胞还含有能分化为神经细胞的少数多能性细胞[3]。最近，出泽等人在真皮纤维芽细胞以及MSC等的成人人间充质细胞中，发现了独特种类的干细胞。由于这些干细胞占MSC整体的百分之几、为应激耐性，因此被命名为多系分化持续应激(Multilineage-differentiatingStressEnduring(Muse))细胞[4]。这些干细胞能够作为阳性细胞有效地分离成公知的人胚胎干(ES)细胞标记的阶段特异性胚胎抗原(StageSpecificEmbryonicAntigen(SSEA))-3。通过使用SSEA-3抗体，利用FACS，能从人骨髄及纤维芽细胞有效地分离Muse细胞[4]。Muse细胞能够自我复制，能够表达Nanog、Oct3/4以及Sox2等与多能性有关的基因，能从单一细胞分化为内胚叶、外胚叶以及中胚叶系统的细胞。在细胞因子诱导下，Muse细胞以约90％的非常高的比例分化为神经元标记物阳性细胞[5]。在动物实验中，在体内进行移植时作为组织修复细胞发挥作用；这些Muse细胞朝向损伤组织移动，在一些疾病动物模型中，自发地分化为适合于归巢了的组织的细胞[4]。实际上，当Muse细胞被直接注射入小鼠的梗塞脑中时，移植到宿主的脑后，能够进入组织中，表达神经元标记物，显著提高功能恢复[6]。与ES细胞或被诱导的多能干细胞(iPS细胞)等公知的多能干细胞不同，Muse细胞的端粒酶活性低，在免疫缺陷小鼠精巢中不会形成畸形[5、7]。
技术实现思路
解决技术问题所采用的技术方案本专利技术人等发现在缺血性脑梗塞的患者中，在其急性期SSEA-3阳性多能干细胞(Muse细胞)从骨髄向外周血液动员，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]一种检测方法，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。[2]根据前述[1]所述的检测方法，从受试者采取的血液样本是在从脑梗塞样症状刚刚发病到60天内所采取的。[3]根据前述[1]或[2]所述的检测方法，多能干细胞是在缺血性脑梗塞的急性期，从骨髄向外周血液动员的干细胞。[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其特征是，将脑梗塞的预后与受试者有无吸烟和/或饮酒相互关联。[5]根据前述[1]～[4]中任一项所述的检测方法，还包括与截断值进行比较的步骤。[6]一种在前述[1]～[5]中任一项所述的检测方法中所使用的试剂盒，包括能够测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的试剂。[7]一种筛选脑梗塞的治疗药物的方法，包括使受试者和脑梗塞的治疗药物的候选化合物接触后，测定来源于该受试者的血液样本中的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤。[8]根据前述[7]所述的筛选方法，还包括与截断值进行比较的步骤。专利技术效果根据本专利技术，能够预测脑梗塞的预后，另外，能够诊断由短暂性缺血发作引起的脑梗塞的风险，此外，对无症状性脑梗塞的诊断也有用。附图说明[图1]图1表示尺寸为小、中以及大的脑梗塞(箭头)的代表性FLAIR图像。[图2]图2表示健康的人(A)以及缺血性脑梗塞(B)的代表性FACS数据。上图表示对照细胞计数数据，中图表示仅具有二级抗体的细胞计数数据，下图表示具有一级及二级抗体的细胞计数数据。SSEA-3阳性细胞在下图中鉴定(箭头)。[图3]图3表示缺血性脑梗塞发病后30天内SSEA-3+细胞随时间变化的曲线图。A)减少了的组、B)未变化的组、以及C)增加了的组。[图4]图4表示显示SSEA-3阳性细胞的小部分(绿色)的人骨髄的荧光免疫组织化学的显微镜照片。比例尺＝50μm。[图5]图5表示年龄与骨髄中的SSEA-3+细胞比例之间的关系。白色圆圈表示没有接受化学疗法的患者的数据，黑色圆圈表示接受了化学疗法的患者的数据。具体实施方式以下，为了对本专利技术进行说明，对优选的实施方式进行详细阐述。本领域技术人员应理解为本专利技术并不限定于以下优选的实施方式，在其主旨的范围内也可以进行各种变形。本专利技术提供一种基于测定在受试者中从骨髄向外周血动员了的多能干细胞(Muse细胞)的数量的、预测受试者的脑梗塞的预后的检测方法、以及在检测方法中所使用的试剂盒等。1.疾病对象本专利技术的目的在于，通过测定SSEA-3阳性多能干细胞(Muse细胞)在血液中的数量，诊断脑梗塞的预后、基于短暂性缺血发作的脑梗塞的风险、以及无症状性脑梗塞。此处，所谓“脑梗塞”是指由于脑血管的堵塞或灌流压的降低，导致在脑中产生局部性的缺血部分，呈现出神经细胞的不可逆的细胞死亡的状态。更具体而言，包括由于脑内小动脉因堵塞而发病的腔隙性梗塞、由于脑内大动脉因动脉粥样硬化堵塞而发病的动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、以及由于心脏内的血栓形成栓子并堵塞脑内动脉而发病的心源性脑栓塞症的任一种。另外，在脑梗塞中也包括急性期、亚急性期、恢复期(慢性期)等任一种。在本专利技术中，将从刚刚发病到60天内的受试者的血液样本作为测定对象。此处，所谓“发病”被定义为最后见到患者正常状态的时间、或者在没有目击者的睡眠中引起脑梗塞时的睡眠时间。在脑梗塞中，根据血栓的来源被分为脑血栓和脑栓塞，本专利技术对脑血栓及脑栓塞，，进而对脑梗塞预后的诊断有用。所谓“短暂性缺血发作”是指由脑循环中血栓栓塞症引起的短暂性急性神经功能障碍。根据本专利技术，能够诊断这种短暂性缺血发作后是否发生脑梗塞的风险。另外，在本说明书中使用时，所谓“无症状性脑梗塞”是指例如，不具有急性并且显性的中风特征的症状，例如轻偏瘫、知觉减退和/或失语症的脑组织的缺血状态。2.多能干细胞在本专利技术的检测方法等中所使用的多能干细胞可以是作为本专利技术人之一的出泽在人生物体内发现其存在、且被命名为“Muse(多系分化持续应激、Multilineage-differentiatingStressEnduring)细胞”的细胞。一般而言，Muse细胞能够从骨髄液、脂肪组织(Ogura，F.，etal.，StemCellsDev.，Nov20，2013(Epub)(publishedonJan17，2014))或真皮结缔组织等皮肤组织获得，也分散在各个内脏器官的结缔组织。另外，该细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测方法，其特征在于，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA‑3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.15 US 62/279,1291.一种检测方法，其特征在于，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，从受试者采取的血液样本是在从脑梗塞样症状刚刚发病到60天内所采取的。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，多能干细胞为在缺血性脑梗塞的急性期从骨髄向外周血动员的干细胞。4.根据权利要求1～3中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：出泽真理，黑田敏，
申请(专利权)人：国立大学法人富山大学，出泽真理，株式会社生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：日本,JP