一种鉴定样品中细菌的方法技术

本发明专利技术描述了一种用于鉴定细菌的方法。特别是，本发明专利技术涉及使用流式细胞仪从受试者痰液样本中鉴定分枝杆菌并进行定量的方法。进一步描述了使用流式细胞仪从痰液派生的样本中鉴定和定量结核分枝杆菌。一旦确定存在结核分枝杆菌并定量，样本将被点样于过滤卡片上，用来验证现有的诊断方法，校准现有的诊断方法，以及/或建立与这些诊断方法结合使用的外部质量控制体系。在一种实施方式中，该方法被用于诊断结核病(TB)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术的背景本专利技术描述了一种用于鉴定细菌的方法。特别是，本专利技术涉及使用流式细胞仪从痰液样本中鉴定分枝杆菌并进行定量计数的方法。进一步描述了使用流式细胞仪从痰液派生的样本中来鉴定和定量结核分枝杆菌，并以此来验证，校准和/或建立用于诊断结核病(TB)的过程中的质量控制体系。尽管一个多世纪以来，检验出的结核分枝杆菌被认为是引起结核病的原因，在资源贫乏的国家，特别是在艾滋病毒感染人群中，诊断结核病仍然是一个挑战。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的疾病，结核分枝杆菌感染是引起发病率和死亡率的一个重要原因，每年有超过900万的新发病例和约180万的死亡人数。由于疾病的传染性，快速鉴定病原对于减少疾病在社区和卫生保健中心的个体之间的传播至关重要。在大多数国家诊断结核病的最常用方法是涂片镜检，该方法成本较低，相对容易 执行，但是检测灵敏度适中(35 80%)。在撒哈拉以南的许多非洲国家中，其感染艾滋病病毒的成人和儿童占全国人口的大多数，此种情况下涂片镜检的灵敏度特别低。被认可的结核病诊断的黄金标准是体外培养结核分枝杆菌，这是高灵敏度的方法，而且能够鉴定结核分枝杆菌，并且分离其药物敏感株和药物耐受株，但是这种方法仍然有很多的局限性。最大的局限性是体外培养结核分枝杆菌需要2-6周的周期，从而降低了它在临床决策中的应用。另一个局限性是，要进行结核分枝杆菌的体外培养，必须在生物安全水平(BSL2 3)，并在特定的实验室运行要求下进行，这个条件在边远的条件缺乏的地方是不容易达到的。即使是使用如BACTEC MGIT960和MGIT DST (BD诊断系统)的液体培养方法仍然存在不足之处，从方法学上来说，仍然是“人力资源”密集的，昂贵的，并且容易出现污染。因此，特别是在艾滋病流行之后，为预防结核病感染，研发新的结核病诊断方法的进度在近期得到了加快。根据StopTB Partnership (http://www. stoptb. org/),现有的和新型的技术被用于诊断发病期和潜伏期的结核病，这些技术被应用于参考实验室，临床外周实验室(POC)，而且这些实验室含有不同类型的技术。这些技术包括(i)诊断和分类分析多重耐药性结核菌株(MDR-TB)的核酸扩增试验(NAAT)，比如 GenoType MTBDR 和 MTBDRplus(HainLifeSciences)，INNO-LiPARif. TB(CapiliaTB-Neo), GeneXpert MTB/RIF (Cepheid),环介导等温扩增技术(TB-LAMP, Eiken ChemicalCo)，COBAS TaqMan MTB(Roche Molecular Systems), Gen-Probe 扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTD)和增强型AMTF(E-AMTF，Gen-Probe), LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒(LCTB, Roche Applied Science), Seeplex TB 检测试剂盒(Seegene, Korea),BD-ProbeTecTM 直接和半自动化 ProbeTecTMET 系统(Becton Dickinson)和 AbbottLCx(Abbott Molecular)ο(ii)用于诊断潜伏性的结核分枝杆菌感染的Y-干扰素释放试验(QuantiFERON -TB Gold In Tube, T-SP0T. TB )，TB斑贴试验同样用于诊断潜伏期感染。(iii)抗原检测，如脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和呼吸分析筛查试验来检测结核病。(iv)噬菌体试验用来快速诊断多重抗药性-结核病(MDR-TB)。(V)其他用来检测药物耐受结核分枝杆菌的方法包括量热氧化还原指示剂法，显微镜观察药物敏感性(MODS)，硝酸还原酶试验，薄层琼脂培养、漂白显微镜、痰液过滤、痰液染色的重要荧光剂染色用于改进后的涂片镜检，发光二极管(LED)荧光显微镜用于改进后的直接涂片镜检。对撒哈拉以南非洲艾滋病流行地区的患者的研究表明，感染艾滋病病毒人群的结核病的发病率比未感染人群闻出8. 3倍。艾滋病病毒阳性的人的涂片镜检结核分枝杆菌的结果多为阴性，难以诊断。世界卫生组织已经针对艾滋病病毒阳性的人的阴性结核分枝杆菌涂片镜检结果建立了算法，用以诊断结核病。对痰液样品进行PCR分析，相对涂片镜检来说，提高了灵敏度，虽然其数值有所变动，灵敏度为O. 85 (范围为O. 36-1. 00)，特异性为O. 97 (范围为O. 54-1. 00)。一种从C印heid发展而来的新的PCR方法，叫做GeneXpert MTB/RIF，其第一例报道的灵敏度和特异性，涂片镜检阳性、结核分枝杆菌培养阳性的患者为·98. 2%，涂片镜检阴性、结核分枝杆菌培养阳性的患者为72. 5%，该方法对检验给出了极大的保证。此外，Witwatersrand生殖健康中心和艾滋病研究中心针对成人肺结核病门诊病人进行的一项研究表明，其中70%的结核病病人同时感染艾滋病病毒，显示单个GeneXpertMTB/RIF试验相对于单个BACTEC MGIT培养法的灵敏度为86%。此方法是一种以实时PCR为基础的体系，只需要2分钟的动手时间，就可以在2小时内得出检测结果，结果中还包括对利福平的敏感性或抗药性。该系统可以随时随地由“非技术熟练”人员操作完成，并且不需要生物安全级别的基础设施。然而，这种方法的局限性是成本较高，并且依赖于当前的模块格式，即仪器目前设置只有1-16，32和48的模块，该模块目前只限于低通量随时检测和小型实验室检测；在高通量实验室，尤其是较高艾滋病/结核病发病率的中心，这仍然是迫切需要解决的问题。尽管存在这些局限性，世界卫生组织已经批准在结核病流行的国家使用GeneXpert MTB/RIF试验来检测结核病，并认定该方法是全球结核病诊断的一个重要里程碑。为了响应全球健康的原则,流行病国家卫生系统实施GeneXpert MTB/RIF试验,而功能性实施该试验有很多方面需要注意。这包括确定与GeneXpert MTB/RIF实施相关的主要物流和操作有关问题(例如，药筒的供应，GeneXpert装置的停机时间)；建立样品数据库用来校准和验证安装的每个GeneXpert仪器得到的结果(在仪器被认可具备出具病人检验结果的资质之前)；生成合适的外部质量评估(EQA)程序以确保实验室和非实验室环境的持续性质量检测。在特定的GeneXpert MTB/RIF检测特性的基础上，可以预测，验证和EQA程序需要满足如下标准1)测试材料必须包含完整的结核杆菌，以便于在GeneXpertMTB/RIF药筒中捕捉信号；2)运输EQA材料的过程必须是安全的；3)测试过程必须是安全的，而且与GeneXpert MTB/RIF当前测试方法相符合，非实验室技术熟练的卫生工作者必须能够在非实验室环境中进行测试，作为国家级的方案测试程序需要具有成本效益和可持续发展性。除了上面描述的技术及其相关的不足之处，在艾滋病流行地区通过鉴定和定量结核分枝杆菌来诊断结核病有一些附加的并发症和影响=HIV感染往往导致痰液量的减少和痰液质量的降低。这将导致结核分枝杆菌培养阳性而其痰液涂片镜检阴性结果的增加。这本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.06 ZA 2010/032151.一种鉴定存在或者不存在细菌的方法，该方法包括如下步骤 i)用流式细胞仪检测受试者痰液样本； ii)在样品中鉴定是否存在这样的区域相对于背景碎片区域，此区域内存在角荧光强度增加以及角侧散射增加或者前向散射增加。2.根据权利要求I的所述方法，其中相对于所述的背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的约40-50°的角度区域。3.根据权利要求I的所述方法，其中相对于所述的背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的45°的角度区域。4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中所述的细菌为分枝杆菌。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述的分枝杆菌选自于如下种属结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌，鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的分支杆菌为结核分枝杆菌。7.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域，不存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者不患有结核病。8.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域，存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者患有结核病。9.根据权利要求I至8中任一项所述的方法，其中所述的背景碎片包括裂解的细胞，粘液或者唾液。10.根据权利要求I至9中任一项所述的方法，其中所述的痰液用核酸结合染料进行处理，该染料选自金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。11.根据权利要求I至10中任一项所述的方法，其中所述的细菌用磁珠、配体或者抗体进行预先标记。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的磁珠、配体或者抗体包含荧光标记。13.根据权利要求I至12中任一项所述的方法，该方法还包括在使用流式细胞仪检测之前，对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理的步骤。14.根据权利要求13所述的方法，其中在对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理之前，培养所述痰液样品。15.根据权利要求I至14中任一项所述的方法，该方法还包括对所述鉴定的细菌进行定量的步骤。16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中对所述的痰液样本进行液化和/或/净化和/或灭活处理的步骤是将所述痰液样本点样到吸附性材料上。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的吸附性材料选自如下几种材料过滤卡片、滤纸、拭子、磁珠、样品池和棉花。18.根据权利要求16或者17所述的方法，其中所述的吸附性材料中含有细菌野生株、参考菌株或者阴性对照。19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料与任何结核病诊断方法配合使用。20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料与任何结核病诊断方法配合使用，用来验证此结核病诊断方法和/或校准此方法和/或作为外部质量控制评估(EQA)的工具。21.根据权利要求19或者20所述的方法，其中所述的诊断方法选自=GenoType⑧MTBDR 和 MTBDRplus 、INNO-LiPA Rif. TB、GeneXpert MTB/RIF、环介导等温扩增技术、COBAS TaqMan MTB, Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验和增强型Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验、LightCycIer 结核分枝杆菌检测试剂盒、Seeplex TB检测试剂盒、BD-ProbeTec 直接和半自动化 ProbeTec ET 系统和 Abbott LCx022.根据权利要求21所述的方法，其中所述的诊断方法是GeneXpertMTB/RIF试验。23.制备含有细菌的吸附性材料的方法，该方法包括以下步骤 i)根...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱斯利·埃里卡·斯科特，
申请(专利权)人：约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学，
类型：
国别省市：