本发明专利技术公开了一种快速检测和鉴定烟草野火病菌及角斑病菌的方法，本发明专利技术方法是根据烟草野火菌和角斑菌中国菌株的ｈｒｐＺ全序列，角斑菌株ｈｒｐＺＳｅｑ ＩＤ ００２，所设计的序列特异性寡核苷酸ＰＣＲ扩增引物对，以及野火毒素生物合成必需基因的特异性寡核苷酸ＰＣＲ扩增引物对，即Ｓｅｑ ＩＤ ００５、Ｓｅｑ ＩＤ ００６等；利用上述引物对和Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，进行ＰＣＲ扩增，根据电泳结果即可于２～５小时内快速鉴定出烟草野火病菌和角斑病菌。与传统的细菌鉴定方法相比，不仅方便、快捷，而且准确、可靠、特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物病原细菌的分子生物学检测鉴定方法，尤其是涉及一 种。
技术介绍
烟草野火和角斑病是烟草上最重要的细菌性叶斑病，发生普遍，条件合适 可以突发性流行，而且可与多种真菌性叶斑病混发。由于单纯地依靠症状和常 规的分离鉴定不能准确鉴别这些病害，往往无法指导病害的防治。现行的植物病原Pseudomonas菌的鉴定主要是根据N. W. Schaad编著的《植 物病原细菌鉴定实验指南》第二版(Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, 2ndedition， 1988)、《伯杰氏细菌学鉴定手册》 第八片反禾口第九丰反 (Bergry' s Manual of Determinative Bacteriology, 8"'edition， 1984， 1994)、《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology, 9th edition, 1974)等书描述的的规范方法进行 形态学分析和理化性状鉴定，包括培养性状、革兰氏染色反应、鞭毛的数量和 着生位置、是否产生色素或荧光色素、一系列的生理生化特性，即采用Lellitt 等1966年提出的一套鉴定荧光菌的L0PAT试验果聚糖产生试验、氧化酶试 验、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解酶试验和烟草过敏性反应(Schaad丽， 1998)、以及对寄主植物的致病性分析。这些传统的鉴定方法不仅费工费时、 可靠性差、在结果的判别上受试验条件和试验者的主观因素影响较大，而且目 前尚无法区分系列性状几乎完全近似的致病变种。在植物病原细菌的检测技术 方面，现行的方法主要是血清学反应，利用多克隆抗体检测细菌菌体，但其灵 敏性和特异性明显不足，不适于植物样品中的待测细菌数量较少时的检测。因 此，从基因组或分子水平上检测鉴定植物病原细菌的分子生物学技术，己经成 为发展的必然趋势。野火和角斑病菌亲缘关系非常近，二者的培养性状、形态学特征和理化性 状完全一致，基因组具有高度的相似性，病理学上二者的重要区别在于野火病菌可以产生野火毒素。但是它们都具有相同的hrpZ基因，基因全长仅有712bp， 它们的hrpZ基因在DNA长度上和碱基序列上不同于其它任何的病原细菌，但 在野火菌和角斑菌的菌株间却非常保守(同源性高达99%以上)，是分子生物 学鉴定上非常有用的特征。因此，根据该基因特征序列设计引物扩增其hrpZ 全长，完全可以将烟草野火菌和角斑菌同其他的细菌区分开来。此外，角斑菌 又缺乏野火病菌的烟毒素Us"ow'/^合成基因(如tblA、 tabA)，所以再依 据GenBank数据库公开的有关基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，便可进 一步准确地鉴别出野火病菌(/^ewGb/^/7assjri/^aepv. 和角斑病菌 (pv.朋g〃Jst3)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种效果良好的快速检测和鉴定烟草野火病菌及 角斑病菌的方法。本专利技术的目的可通过以下措施来实现本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001，角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的特异性寡核苷酸 PCR扩增引物对，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成必需基 因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、 Seq ID 006。利用上 述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为模板， 进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，2Q 50ul反应体系，PCR产物用0. 5 1. 4%的琼脂糖凝胶电泳检査，根据电泳结果即可于2 5小时内快速鉴定出烟草野火 病菌和角斑病菌。本专利技术与传统的细菌鉴定方法相比，不仅方便、快捷，而且准确、可靠、 特异性强。该方法的优点是，节约时间，提高了准确性和特异性；PCR检测鉴 定法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较形态鉴定和生理生化鉴定方法更 为准确；适用于单个病斑、细菌分离物或单个菌落的检测。既可进行定性检测也可进行半定量检测。 具体实施例方式本专利技术以下结合实施例作以详细的描述 实施例1本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ SeQ ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的序列特异性寡核 苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为 模板，进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，20ul反应体系，PCR产物用0. 5%的琼 脂糖凝胶电泳检查，根据电泳结果即可于2小时内快速鉴定出烟草野火病菌和 角斑病菌。本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的序列特异性寡核 苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为 模板，进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，25ul反应体系，PCR产物用0. 8%的琼 脂糖凝胶电泳检査，根据电泳结果即可于3小时内快速鉴定出烟草野火病菌和 角斑病菌。实施例3本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的序列特异性寡核 苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为模板，进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，30ul反应体系，PCR产物用1%的琼脂 糖凝胶电泳检查，根据电泳结果即可于3. 5小时内快速鉴定出烟草野火病菌和角斑病菌。 实施例4本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的序列特异性寡核 苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为 模板，进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，40ul反应体系，PCR产物用1. 2%的琼 脂糖凝胶电泳检査，根据电泳结果即可于4小时内快速鉴定出烟草野火病菌和 角斑病菌。实施例5本专利技术方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrp本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测和鉴定烟草野火病菌及角斑病菌的方法，其特征在于：本专利技术方法是根据烟草野火菌和角斑菌中国菌株的ｈｒｐＺ全序列，即野火菌株ｈｒｐＺＳｅｑＩＤ００１，角斑菌株ｈｒｐＺＳｅｑＩＤ００２，所设计的序列特异性寡核苷酸ＰＣＲ扩增引物对，即ＳｅｑＩＤ００３、ＳｅｑＩＤ００４，以及野火毒素生物合成必需基因的特异性寡核苷酸ＰＣＲ扩增引物对，即ＳｅｑＩＤ００５、ＳｅｑＩＤ００６；利用上述引物对和ＴａｑＤＮＡ聚合酶，以细菌基因组ＤＮＡ５０～４００ｎｇ或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为模板，进行ＰＣＲ扩增，反应体系２０～５０ｕｌ；ＰＣＲ产物用０．５～１．４％的琼脂糖凝胶电泳检查，根据电泳结果即可于２～５小时内快速鉴定出烟草野火病菌和角斑病菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋士君，赵志，王枫，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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