使用捕获标记物的三磷酸化寡核苷酸的纯化制造技术

本发明专利技术涉及使用捕获标记物制备三磷酸修饰的寡核苷酸的方法。该方法可以以高产量和适用于药物应用的纯度合成和纯化三磷酸修饰的寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用捕获标记物的三磷酸化寡核苷酸的纯化描述本专利技术涉及使用捕获标记物制备三磷酸修饰的寡核苷酸的方法。该方法可以以高产量和适用于药物应用的纯度合成和纯化三磷酸修饰的寡核苷酸。专利技术背景Schlee等，Immunity，2009，31，25-34描述了在一条链上携带5’-O-三磷酸酯部分的钝端双链RNA，通过结合RIG-I解螺旋酶，作为有效的免疫系统的刺激剂。因此，对提供简单且有效的用于制备适用于药物应用的高纯度三磷酸修饰的寡核苷酸的方法存在需求。三磷酸酯基团或其类似物与核苷化合物的5’-OH基团的偶联是本领域公知的。LudwigJ.等，J.Org.Chem.1989，54，631-635公开了使用2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮作为亚磷酸化剂的用于制备核苷和类似物的5’-O-三磷酸酯的溶液三磷酸化方法。GaurR.K.等，1992，TetrahedronLetters，33，3301-3304描述了在固相上使用所述方法，用于合成2’-O-甲基核糖核苷5’-O-三磷酸酯及其Pα-硫代类似物。美国专利6,900,308B2公开了作为潜在抗病毒化合物的修饰核苷5’-O-三磷酸酯的固相合成，而美国专利7,285,658、7,598,230和7,807,653公开了在糖、核碱基和三磷酸酯部分中具有修饰的核苷三磷酸酯类似物。WO96/40159描述了用于生产加帽的RNA或RNA类似物分子的方法，其中将RNA或RNA类似物寡核苷酸与亚磷酸化剂（如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮或其环取代的衍生物）反应。将所得到的中间体与磷酸酯或焦磷酸酯或其氧化的或水解的盐反应。通过与激活的m7G三-、二-或单磷酸酯或类似物反应，将二-或三磷酸化RNA或RNA类似物加帽。WO2009/060281描述了含有修饰的寡磷酸酯部分的免疫刺激寡核糖核苷酸类似物和用于制备这些化合物的方法。该方法包括在固体支持物上合成寡核苷酸，在合适的溶剂中，并且在碱的存在下，在寡核苷酸的5’-端，将核苷酸与亚磷酸化剂（如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮）反应，将亚磷酸化的寡核苷酸与焦磷酸酯或焦磷酸酯类似物反应，用氧化剂氧化寡核苷酸，并且将寡核苷酸去保护，以产生三磷酸酯-或三磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸。WO96/40159中使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳只可用于小规模分离。用于较长寡核糖核苷的5’-单-、二-、三磷酸化产品的离子交换色谱的分辨力受到限制。所需的变性条件使得分离是个冗长乏味的任务（Sproat，1999；Zlatev，2010；WO2009/060281），此外，产品通常受到正-1、正-2序列及其单-和二磷酸酯的污染，导致纯度不足。已知对RIG-I配体的精确末端结构的敏感性，这些纯化方法对药物应用是次最佳的。双重靶向策略（siRNA和RIG配体）需要与纯化方法无关的通用序列。专利技术概述大规模生产用于潜在临床使用的5’-O-三磷酸化寡核苷酸及其类似物是高度理想的，并且方便的制备方法也是非常需要的。在本申请中，显示了用捕获标记物（例如，癸胺）可以将固相结合的全保护寡核苷酸的5’-O-环三磷酸酯中间体（参见图1）的环打开，产生对RNA的去保护稳定的Pγ标记的物质。标记物的性质使得捕获标记的三磷酸酯物质特异性停留在捕获标记物特异性试剂上。如果需要，可以按序除去标记物。该方法可以延伸至包括三磷酸酯部分的类似物，例如，含有替代氧原子的例如β,γ-亚甲基、氟代亚甲基、二氟亚甲基和亚氨基的类似物。捕获标记方法的优势是所需物质的简单纯化和提高的回收，例如，在室温下，通过RP-HPLC或亲和性色谱，任选地紧接着在合适的条件下捕获标记物的切割。优选实施方案的详述本专利技术描述了含有捕获标记物的三磷酸寡核苷酸的合成和纯化，包括其类似物。最广泛使用的用于标准5’-OH寡核苷酸的HPLC纯化的方法是三苯甲基-ON寡核苷酸的反相色谱。本专利技术中所述的方法提供了实际的解决方法，对于5’-三磷酸化寡核苷酸具有相似的功效。因此，本专利技术的主题是制备式（I）的寡核苷酸的方法，其中V1、V3和V5在每种情况中独立地选自O、S和Se；V2、V4和V6在每种情况中独立地选自OH、OR1、SH、SR1、F、NH2、NHR1、N(R1)2和BH3-M+，W1是O或S，W2是O、S、NH或NR2，W3是O、S、NH、NR2、CH2、CHHal或C(Hal)2，R1、R2和R3选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C2-6酰基或环基，各自任选被取代，或其中两个R1可以和与其结合的N-原子一起形成环，M+是阳离子，X是NH、NR3、O或S，Z表示捕获标记物，Y表示连接所述捕获标记物与X的键或连接物，和ON表示包含至少4个核苷酸或核苷酸类似物结构单元的寡核苷酸，所述方法包括下列步骤：（a）将式（IIa）的化合物与氧化剂反应，其中V1、V3、V5、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，以获得式（IIb）的化合物其中V1、V3、V5、V2、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，（b）将氧化的化合物与式（III）的捕获标记物试剂反应，Z-Y-XH（III）其中X、Z和Y如上所述，以获得包含式（I）的寡核苷酸的反应产物，和（c）在允许寡核苷酸（I）与所述反应产物中所含的其他物质分离的条件下，将步骤（b）的反应产物与能够与所述捕获标记物相互作用的试剂接触。任选地，该方法进一步包括步骤（d）除去捕获标记物，以获得式（IV）的寡核苷酸，其中V1、V3、V5、V2、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上所述。在不引起三磷酸酯部分降解的条件下进行该步骤，例如，如以下详细描述的条件。在进一步的实施方案中，捕获标记物没有除去或没有完全除去。在这些实施方案中，如此标记的寡核苷酸可以具有实用性，例如，作为药剂的实用性。在本申请内容中的术语“寡核苷酸”包括含有多个（例如，至少4个）核苷酸或核苷酸类似物结构单元的化合物。优选地，寡核苷酸包括6-100个，例如，20-40个结构单元。核苷酸或核苷酸类似物结构单元可以包括由亚基间连接连接的核苷酸或核苷酸类似物亚基。核苷酸亚基包括脱氧核糖核苷亚基、核糖核苷亚基和/或其类似物，特别是糖-和/或核碱基-修饰的核苷类似物。此外，寡核苷酸可以包含非核苷酸结构单元和/或更多的末端和/或侧链修饰。在优选的糖修饰亚基中，核糖核苷亚基的2’-OH被选自OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。在进一步优选的糖修饰亚基中，核糖可以是取代的，例如，被另一种糖取代，例如，戊糖，如阿拉伯糖。这种糖修饰可以结合如上所述的2’-OH修饰，如2’-氟代阿拉伯核苷亚基中的修饰。再进一步优选的糖修饰亚基包括锁核苷（LNA）或2’,3’-断-核苷（UNA）。在优选的核碱基修饰的核苷结构单元中，替代标准核碱基，使用非标准的，非天然产生的核碱基。非标准的核碱基的实例是5-位的尿嘧啶或胞嘧啶，例如，5-(2-氨基)丙基尿嘧啶或5-溴尿嘧啶；次黄嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；8-位修饰的腺嘌呤或鸟嘌呤，例如，8-溴鸟嘌呤；去氮核苷，例如，7-去氮鸟嘌呤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.28 EP 11160032.61.制备式(I)的寡核苷酸的方法，其中V1、V3、V5、W1、W2和W3为O；V2、V4和V6为OH，X是NH，Z表示捕获标记物，其为C10-C18烷基残基或F3C(CF2)6F2C-，Y表示连接所述捕获标记物与X的键或连接物，其中所述连接物选自-CH2-CH2-[(O-CH2CH2)]3-和-CH2-CH2-CH2-，和ON表示包含至少4个核苷酸结构单元的寡核苷酸，所述方法包括下列步骤：(a)将式(IIa)的化合物与氧化剂反应，其中V1、V3、V5、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，以获得式(IIb)的化合物其中V1、V3、V5、V2、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，(b)将式(IIb)的化合物与式(III)的捕获标记物试剂反应，Z-Y-XH(III)其中X、Z和Y如上限定，以获得包含式(I)的寡核苷酸的反应产物，和(c)将步骤(b)的反应产物与能够与所述捕获标记物相互作用的捕获试剂接触，其中所述接触在允许寡核苷酸(I)与所述反应产物中所含的其它物质分离的条件下进行，其中能够彼此相互作用的捕获标记物和捕获试剂选自：(i)C10-C18烷基残基，和对疏水基团具有亲和性的色谱材料；和(ii)F3C(CF2)6F2C-和对氟化的基团具有亲和性的色谱材料。2.权利要求1的方法，其中能够彼此相互作用的捕获标记物和捕获试剂选自C10-C18烷基残基，和RP-HPLC的固相或疏水相互作用色谱的固相。3.权利要求1的方法，其中Z表示捕获标记物，其为正癸基、正十二烷基、正十四烷基或正十八烷基。4.权利要求1的方法，其中三磷酸酯基团与寡核苷酸的5’-端连接。5.权利要求1的方法，其中三磷酸酯基团与其5’-端糖的5’-OH-基团连接。6.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸由与其共价连接的细胞特异性靶向实体组成。7.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸选自脱氧核糖核苷酸，和核糖核苷酸。8.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是单链或双链的。9.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸是双链的，并且双链体在其远端通过环闭合，其中所述环由核苷酸和/或非核苷酸结构单元组成。10.制备式(IV)的寡核苷酸的方法，其中V1、V3、V5、W1、W2和W3为O；V2、V4和V6为OH，且ON代表包含至少4个核苷酸结构单元的寡核苷酸，所述方法包括下列步骤：(a)将式(IIa)的化合物与氧化剂反应，其中V1、V3、V5、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，以获得式(IIb)的化合物其中V1、V3、V5、V2、V4、V6、W1、W2、W3和ON如上限定，(b)将式(IIb)的化合物与式(III)的捕获标记物试剂反应，Z-Y-XH(III)其中X是NH，Z代表捕获标记物，其为...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·路德维希，M·戈尔德克，B·斯普罗特，
申请(专利权)人：波恩莱茵弗里德里希·威廉大学，
类型：
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