本发明专利技术公开了粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用，本发明专利技术通过对粗毛韧革菌菌种进行扩大培养，从试管斜面、液体摇瓶、种子培养和菌体分离，利用菌体作为催化剂，转化银杏内酯合成银杏内酯B，转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、无水酒精结晶把银杏内酯B从发酵液分离出来。利用该方法所得到的银杏内酯B的纯度≥99％，银杏内酯转化率>90％。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用，本专利技术通过对粗毛韧革菌菌种进行扩大培养，从试管斜面、液体摇瓶、种子培养和菌体分离，利用菌体作为催化剂，转化银杏内酯合成银杏内酯B，转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、无水酒精结晶把银杏内酯B从发酵液分离出来。利用该方法所得到的银杏内酯B的纯度≥99％，银杏内酯转化率>90％。【专利说明】粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用
本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用。
技术介绍
研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一，是一类特异有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受体拮抗剂。血小板活化因子是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷酯，是目前发现的最有效的血小板聚集诱导剂，与许多疾病的产生、发展密切相关。银杏内酯作为PAF受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用。研究发现银杏内酯B对中枢神经系统与缺血损伤有保护作用，抗休克、抗过敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反应。同时还发现银杏内酯B可降低肝门静脉压提高全身血管耐受性，说明它对肝硬化有一定的疗效。银杏内酯对于肾损伤有治疗作用。这些作用都与银杏内酯B作为 PAF受体拮抗剂有关，并且它目前被认为是作用最强的、最有临床应用前景的天然血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂。目前国内外生产银杏内酯B的方法主要是从银杏叶提取物，已见报导的银杏内酯B的专利共有51篇，其中一部分是关于银杏内酯B的制剂的制备(如:一种银杏内酯B固体分散体及其制备方法，申请号:CN200910204198.4)，三篇关于银杏内酯B及其衍生物的生理学功能(银杏内酯B的一种新用途；申请号:CN200910092750.5 ;银杏内酯B衍生物在制药中的新用途，申请号:CN200910234319.X ;银杏内酯B水解衍生物及其用途，申请号:CN201010122039.2)。而关于银杏内酯B的制备只有九篇(一种从银杏叶或银杏叶提取物中提取银杏内酯B的新方法，申请号200510063407.X ;—种从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B的方法，申请号:CN201010608847.X，等等)，银杏内酯中含有银杏内酯A、B、C、M等同系物，这些专利是采用分离技术从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B，难以在工业上大批量生产银杏内酯B。
技术实现思路
本专利技术提供的是粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用，该以粗毛韧革菌(Stereum hirsutum)为菌种通过液体培养技术得到菌体,菌体作为催化剂,转化银杏内酯A、C和M生成银杏内酯B，以及通过提取步骤获得银杏内酯B制品。本专利技术一方面涉及粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用，其特征在于包括如下步骤:在银杏内酯(包括银杏内酯A、B、C和M)加入蒸馏水和酸，调节ρΗ6.0-7.0，配成20-30克银杏内酯/升的反应液，将粗毛韧革菌和反应液按照重量/体积1:20-30混合，在温度20-30°C，搅拌速率100-150转/分钟，反应10小时以上；反应之后的反应液按照4000-6000转/分钟离心10_20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节PH2.0-3.0,连续用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于_20°C以下结晶70小时以上，过滤，滤渣水洗，干燥得到银杏内酯B。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的粗毛韧革菌通过如下方式获得:以粗毛韧革菌为出发菌株，进行试管菌种传代、液体摇瓶菌种、种子罐菌种、催化转化等步骤制得含有银杏内酯B的转化液，含有银杏内酯B的转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、浓缩、酒精复溶，-20°C结晶、过滤、烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体。其中所述的试管菌种的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994:P367);其中所述的试管斜面菌种培养工艺为斜面菌种切成4X4mm小块菌种，挑取一小块转接含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中，20-32°C培养5-20天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4°C保存备用；其中所述的液体摇瓶培养基组成为(单位为克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-20，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，加水至适当体积，起始pH值为5.0-8.0，100-140°C灭菌20-60分钟；其中所述的摇瓶培养的培养条件是:250mL三角瓶装液量为60-150mL，接种3-4块4X4mm小块菌种，置于温度22-30°C，转速120-160转/分钟，培养时间24-48小时；其中所述的种子罐培养的培养基组成为(单位为克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-10，KH2PO4I-6，MgSO41-4，消泡剂0.1-0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0-8.0,100-140°C灭菌20-60分钟；其中所述种子罐的培养条件是:接种量5-10% (种子液体积/接种后体积),培养温度22-30°C，搅拌速率90-150转/分钟，通风量1:0.3-Iv / V / m，培养时间80-90小时；其中所述转化反应液为(单位为克/升):银杏内酯10-50，起始pH值为5.0-8.0 ;其中所述的转化工艺条件是:种子液4000-6000转/分钟，离心5-20分钟，收集菌体，菌体与反应液按1:5-50 (重量:体积)混匀，在温度22-30°C，搅拌速率90-150转/分钟，通风量1:0.3-Iv / V / m，反应6-18小时；其中所述的银杏内酯B提取工艺为，转化液4000-6000转/分钟离心10-20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pHl.0-4.0，连续用0.3-3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于_20°C结晶24-120小时，过滤，滤渣水洗，80°C干燥得到银杏内酯B纯品。`本专利技术所使用的粗毛韧革菌菌种为金耳的伴生菌，可选任意一种金耳子实体，例如云南、西藏或山西的金耳子实体，通过组织分离即可得到野粗毛韧革菌菌种。该菌不形成或很难形成子实体，菌丝体遇氢氧化钾溶液变暗或变黑。生殖菌丝疏松地交织在一起，分枝，有锁状联合，近无色。本专利技术所述的工艺银杏内酯B白色，纯度> 99%，银杏内酯转化率>90%。根据此工艺采用的银杏内酯测定方法为:精密称取银杏内酯B对照品10mg，溶于ImL色谱级甲醇中，配制成10mg/mL的标准液。0.2 μ m微孔滤膜过滤，控制进样量为1,2, 3,4, 5，6，7和8μ 1，利用高效液相色谱仪(HIMADZU(岛津)LC-20AT)测定银杏内酯B含量。色谱柱为硅胶柱(4.6.ιΧ250πιπι，5μπι)。测定条件为流动相:甲醇:0.1 %磷酸溶液=10:90 ;柱温:30°C，流速:0.8mL / min，检测波长:270nm。以进样量为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得银杏内酯浓度与峰面积的线性回归方程。吸取样品液(发酵过程中和发酵后)的上清液少量，用0.45 μ m微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分别测定峰面积，采用外标峰面积本文档来自技高网...
【技术保护点】
粗毛韧革菌菌体在制备银杏内酯B中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张志才，
申请(专利权)人：张志才，
类型：发明
国别省市：
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