一种调控CYP基因表达水平的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种调控非人类哺乳动物细胞色素P450(CYP)基因表达水平的方法以及该方法在产生非人类哺乳动物模型中的应用；进一步的，本发明专利技术提供了利用该方法产生的动物模型，以及动物模型在临床前药物研究中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种调控非人类哺乳动物体内CYP450基因表达水平的方法以及，该方法在制备产生非人类哺乳动物模型系统中的应用；进一步的，本专利技术涉及利用该方法产生的动物模型系统，以及动物模型系统在医学、药理学、临床前药物研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用，尤其是临床前药物研究中的应用。
技术介绍
细胞色素P450 (Cytochrome P450,或简称CYP或P450)是一个亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族，人类具有55个功能基因和29个假基因；根据基因序列的同源性，该基因超家族可被进一步分为17个基因家族和42个亚家族。在细胞中，CYP蛋白主要分布在内质网和线粒体内膜上，作为一种末端加氧酶，参与了生物体内主要的内源性物质和外源物质的代谢过程，包括留醇类激素的合成、药物代谢等。CYP1A2与临床药物代谢下面以CYP1A2为例，说明CYP基因家族在临床药物代谢中的作用。CYP1A2是一种由多环芳香烃诱导的CYP亚型，主要在肝脏表达，人类肝脏中CYP1A2基因的表达量约占总CYP蛋白量的13%。在不同个体中，CYP1A2基因的表达水平差异较大，并且受非遗传因素的影响，同时还具有明显的种族及性别差异。CYP1A2主要参与咖啡因、非那西丁、醋氨酚、17 0-雌二醇、普洛萘尔、维拉帕米、硝苯地平、丙咪嗪等20余种药物的代谢，并在十余种前致癌物的激活或灭活中发挥重要的作用。研究表明，CYP1A2基因生理活性的高低与药物的疗效、毒性以及某些肿瘤的易感性密切相关。CYP酶与药物不良反应临床治疗中，绝大多数患者都存在多药并用的情况，因为药物间的相互作用导致的不良反应也呈逐年上升趋势，这已成为医疗实践中一个亟待解决的问题。据世界卫生组织药物不良反应协作中心报告，1986至1996年十年间，由第二代抗组织胺药造成的不良反应死亡报告就多达100多例，发生机制正是由于药物间的相互作用导致患者严重心律失常。美国的一项研究结果表明，住院患者中严重药物不良反应的发生率为6.7%，致死性药物不良反应的发生率为0.32%，因药物相互作用导致的致死率已排名住院患者死亡原因的第四至第五位。不仅如此，药物不良反应导致美国FDA在1980-1998年之间，将13种批准上市的新药从市场上撤出。过去由于对药物间相互作用的认识不够，通常其咎于患者的个体差异，没有给予充分的重视。随着生物技术的发展，人们逐渐认识到药物间的相互作用以及由此导致的不良反应与CYP基因家族的功能密切相关。研究表明，CYP与药物分子的结合和催化能力与药物的结构特征相关，即使是同一类药品，它们的酶学基础也可能存在差异，这就对CYP在药物代谢中作用的研究提出了更高的要求。CYP酶与药物代谢及药物临床研究美国最近公布的一项调查报告指出，临床药物研究过程中只有大约10%的候选药物可最终进入市场，大约40%的候选药物是由于无体内活性或药代动力学参数不佳而 被淘汰。通常情况下，新药研究的过程一般可分为药物设计和新药开发两个阶段。在药物开发阶段，需要对候选物进行代谢、毒性及药效评估，药物代谢研究、尤其是CYP超家族在药物代谢中作用的研究是其中的一个重要方面。在研究开发的早期，首先利用各种体外模型对候选物的代谢特性(参与代谢酶的种类，活性代谢物的生成，对CYP酶的诱导、抑制等)进行高通量分析，确定药物是否有继续开发的价值；然后利用实验动物模型对药物的体内代谢进行研究，根据研究结果推断药物在人体内的生物转化模式。体外研究模型目前主要有CYP cDNA体外表达的代谢酶、体外培养的H印G2、Caco-2和HT29-18-C1细胞株、肝微粒体、肝细胞悬液、以及肝切片等。因其简便易行，这些体外模型被广泛地应用于新药开发的各个阶段。一般认为，由体外模型研究鉴定的药物代谢特征可在一定程度上反映药物的体内代谢情况；但与体内复杂的代谢环境和过程相比，体外模型研究存在明显的技术不足，比如在体内代谢中，一种药物的代谢过程通常可以被多种同工酶或不同酶系统催化调节；而一种CYP通常又可以催化多种药物的体内代谢。这种药物体内代谢反应的复杂性源于药物代谢酶系统的多样性，因此需要在更高的体系层面上对其进行研究，尤其是整体动物水平。在体药物代谢模型在药物临床前研究中，不仅要对药物的体外代谢、药效、效应机制等方面进行研究，还需要选定合适的动物种类进行药物代谢的体内实验。进一步的，FDA从1998年开始要求新药申报时尽量提供药物体内相互作用的研究资料，期望能够减少因严重的体内相互作用导致上市药物被淘汰的风险，保证患者的用药安全。其中一个重要的方面就是研究CYP基因家族成员在药物代谢过程中的作用。除了利用野生型动物进行这些研究以外，研究人员还进一步建立了若干CYP代谢酶基因敲除和人源化转基因小鼠动物模型，使得能够在尽可能模拟人体复杂环境的生物体系中开展药物代谢研究。药物代谢研究中的问题及解决方案与野生型动物相比，转基因动物模型的建立为CYP研究提供了一个更优化的技术方案，但因其周期长、费用高、以及基因功能代偿等原因，使得该项技术的应用还非常有限。在药物代谢常用的大动物模型，如犬、猴等动物中，转基因技术尚不成熟。为了从根本上解决药物研发中的这个问题，本专利技术将在体RNA干扰技术或基因工程过表达技术应用于药物代谢研究，利用体内递送系统将能够抑制某种CYP基因表达的寡聚核酸分子(siRNA、miRNA或其类似物)或其表达载体、能够表达某种CYP基因的表达载体导入非人类哺乳动物体内，降低或提高目的CYP在动物体内的表达水平，从而研究目的CYP在药物代谢中的作用。
技术实现思路
本专利技术涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题:1、一种在非人类哺乳动物体内操纵细胞色素P450 (CYP)基因表达水平的方法，包括以下步骤:I)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与体内递送载体接触； 3)将步骤2中的核酸分子-体内递送载体复合物导入所述非人类哺乳动物体内。2、根据段落I所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为非病毒体内递送载体，该方法包括以下步骤:I)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与所述非病毒体内递送载体接触，形成复合物；3)将步骤2中形成的复合物导入所述非人类哺乳动物体内；4)检测目的CYP基因在步骤3)获得的非人类哺乳动物体内的表达水平。3、根据段落I或2所述的方法，其特征在于同时操纵两种或两种以上CYP基因在非人类哺乳动物体内的表达水平。4、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述非人类哺乳动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、或猴；优选为小鼠、大鼠、狗或猴。5、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够表达目的CYP基因的表达载体为包含目的CYP基因的全部或部分基因组序列的真核细胞表达载体。6、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够表达目的CYP基因的表达载体为包含目的CYP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在非人类哺乳动物体内操纵细胞色素P450(CYP)基因表达水平的方法，包括以下步骤：1)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤1中的寡聚核酸分子或表达载体与体内递送载体接触；3)将步骤2中的核酸分子?体内递送载体复合物导入所述非人类哺乳动物体内。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：杜权，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：