分析翻译调控的基因表达的方法技术

本发明专利技术涉及分析基因表达的方法，它使得考虑存在于细胞类型、组织或生物体中的翻译状态成为可能，以便将由待研究基因转录的ｍＲＮＡ的含量与由该ｍＲＮＡ翻译的蛋白的含量可靠地关联起来。由待研究基因转录的以及编码特定蛋白所有ｍＲＮＡ变体的翻译效率的确定，使得有可能与其它方法一起鉴定在特定细胞类型、组织或生物体中优先翻译的ｍＲＮＡ变体。根据优先翻译的编码待研究蛋白的ｍＲＮＡ变体的含量以及翻译效率，有可能可靠地预测在细胞类型、组织或生物体中表达的蛋白的含量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转录分析领域的方法，且尤其包括和试剂盒。所述方法基于对由待研究的一个或多个基因转录的mRNA变体5’UTR的翻译效率的分析。有关由待研究的一个或多个基因转录的多种mRNA变体翻译效率的数据优选是数据库系统的一部分，所述数据连同特别设计的转录分析工具，通过鉴定并定量由一个或多个基因转录的多种mRNA变体，能够就待研究细胞类型、组织或生物体中蛋白质的含量进行精确的预测。基因表达产物-蛋白质-是细胞功能的承担者。已经可以证明基因表达调控在生物过程如胚胎发生、组织修复、老化或致瘤性转化中起着必不可少的作用。真核细胞的基因表达在转录水平、转录后(RNA多聚腺苷酰化、mRNA剪接、成熟mRNA自核向胞质的输出以及RNA的靶向降解)、翻译或翻译后水平受到调控。翻译水平的表达调控代表了新的调控基因表达的关键性调控机制。已经证明了多种生长因子、细胞因子、激素受体、蛋白激酶、转录因子、翻译机器元件以及细胞周期和凋亡调节子表达的翻译调控。编码表达处于翻译调控之下的基因的mRNA以不寻常的结构而著名。多数mRNA的5’非翻译区(5’UTR)正常为10个核苷酸(N)到200N之间的长度。大约三分之二编码原癌基因或者参与细胞分裂的因子的mRNA具有长于200 N的5’UTR和/或包括不止一个起始密码子。迄今为止已知的在mRNA 5’UTR的帮助下调控蛋白质生物合成起始的机制在下文详细描述。长的结构性5’UTR的翻译调控根据核糖体扫描模型，当包含高比例鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的稳定的二级结构和序列片断存在于mRNA 5’UTR时，能够非常有效地抑制蛋白质生物合成的帽-依赖性起始。体外研究已证明具有30-70kcal/mol自由能的mRNA 5’UTR中的发夹结构能够有效地抑制翻译。因而，也有可能证明编码特定蛋白且具有表现出此类结构的5’UTR的mRNA仅仅非常被微弱地翻译，而编码同一蛋白且具有不稳固(weaker)结构的较短5’UTR的mRNA被相当更为有效地翻译。上游开放读框(uORF)的翻译调控翻译起始的核糖体扫描模型表明蛋白质合成起始于5’-最接近的起始密码子。许多具有长5’UTR的mRNA在编码区首个起始密码子上游包含一个或多个额外的起始密码子或者一个或多个uORF，对下游编码区的翻译具有抑制效果。与编码同一蛋白且其长5’UTR包含一个或多个额外的起始密码子或uORF的mRNA相比，编码特定蛋白并且其5’UTR相当短且不含额外的起始密码子或者uORF的mRNA被相当更为有效地翻译。内部核糖体进位(IRES)的翻译调控翻译的内部起始最初发现于细小核糖核酸病毒中，其mRNA没有5’帽结构，并具有长约1000N且额外包含大量uORF的结构性5’UTR。尽管存在这种根据核糖体扫描模型有效抑制翻译起始的5’UTR结构，细小核糖核酸病毒的RNA在体外和体内被有效地翻译。细小核糖核酸病毒RNA 5’UTR的二级结构利于核糖体亚基的结合以及翻译的帽-依赖性起始(内部核糖体进位→IRES)。在多种其它病毒的RNA中也已经发现了具有相似结构的5’UTR。同样也已经可能检测在真核细胞中转录的各种细胞mRNA 5’UTR中的一个或多个IRES。其5’UTR包含IRES的mRNA能够不依赖于5’-7甲基-G帽结构而在过表达真核起始因子eIF 4E的细胞中翻译。就这点而言，也有可能证明与编码同一蛋白但其5’UTR包含IRES的mRNA相比，编码特定蛋白且具有不稳固结构的短5’UTR的mRNA被相当更为有效地翻译。mRNA 5’UTR中的一个或多个IRES元件使得该mRNA在病毒感染后或在eIF4E过表达细胞中能够有效翻译。在正常状态下，具有此长度的结构性5’UTR妨碍帽-依赖性翻译起始。有可能证明多个mRNA变体自表达在翻译水平调控的基因转录。自特定基因转录的所有mRNA变体具有完全相同的编码区序列。在多数研究案例中，主转录本具有长的结构性5’UTR，而次转录本具有结构不稳固的较短5’UTR。这些mRNA变体的起源可归因于不同转录起始位点的使用以及前-mRNA的选择性剪接。例如，由bcl-2基因转录两个mRNA变体。bcl-2基因的主转录本具有长度大于1000N且包含多个uORF的5’UTR。而bcl-2次转录本具有长约80N且结构不稳固的5’UTR，而且被优先翻译。次转录本的比例约为bcl-2mRNA总量的5％。通过外部影响例如辐照、化学制品、细胞生长抑制剂、激素、细胞因子、生长因子或胁迫诱导，使优先翻译的bcl-2转录本的转录速率加倍，导致蛋白浓度的加倍。bcl-2 mRNA的总量整体增加5％。利用传统的转录分析方法，不可能充分准确地测定这些变化以预测蛋白含量的变化。蛋白质例如生长因子、细胞因子、激素受体、蛋白激酶、转录因子、翻译器(apparatus)元件以及细胞周期和细胞凋亡调节剂，在神经退行性变紊乱、自身免疫病或癌症的发展和发病机理中起着关键性作用。肿瘤细胞多药物抗性以及某些所谓的免疫逃逸区域的发展同样受上述蛋白的影响。编码这些蛋白的许多基因的表达是在翻译水平调控的。这些蛋白含量的变化可借助于术语“蛋白质组学”所概括的方法分析。然而，所有已知的分析和/或定量蛋白质的方法受到包括例如2D凝胶的有效分辨率、蛋白染色方法的选择性或者抗体的可获得性的限制。另外，几乎所有分析蛋白的方法耗时、费力，且在有些情况下与相当大的仪器开销有关，以至于它们不能够直接地在临床路径或者高通量的操作中使用。为避免与蛋白质组学相关的问题，通常特定蛋白含量的变化是借助于编码该蛋白的mRNA的含量变化预测的。在其帮助下有可能测定由一个或多个基因转录的mRNA的含量的方法包括Northern印迹、条形及斑点杂交、核酸酶保护测定法、PCR以及DNA阵列。特别是基于PCR的方法和用于转录分析的DNA阵列使得分析大量样品成为可能，因为它们的操作相对不复杂并且能够自动化。在当前的实验室实践中，由基因转录的mRNA的含量是通过检测该mRNA的编码区确定的。已经有可能证明编码特定蛋白的mRNA的含量不是实际存在的相应蛋白含量十分准确的指标，因为在多于50％的调查基因中，检测到的蛋白含量与所检测到的RNA的含量不相关。如果特定基因的表达在翻译水平上调控，则有可能利用上文详述的方法仅确定由该基因转录的所有变体的总量。存在于组织或细胞类型中的蛋白含量相对精确的估计可以通过分析结合到多核糖体上的转录本实现，因为它们代表了活跃翻译的mRNA。多核糖体结合的mRNA分子的数目是可信的相应蛋白翻译速率的指标，因为通常公认翻译控制主要是发生在起始阶段期间。分离多核糖体结合的mRNA需要在防止RNA-蛋白复合体或者RNA-核糖体复合体解离的条件下分离胞质RNA。然后从单体和未结合的mRNA中通过蔗糖梯度由超速离心分离多核糖体。分离核RNA和胞质RNA以及随后的超速离心步骤难以自动化，因而要并行处理大量样品。在诸如临床诊断或工业药物研究领域中，有赖于自动化方法以确保高样品通量，需要使得可信地预测蛋白表达量成为可能的实现有利的表达分析的方法。通过转录分析精确预测蛋白含量使得描述细胞、组织或生物体的功能关系成为可能，这使得测定药物的作用、副作用及靶分子成为可能。然而，现有技术中可整合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相基质，其上多点固定有至少两种不同的单链核酸（探针），所述探针具有来自特定基因的部分基因组核苷酸序列的１０到４０个连续核苷酸，特征在于：第一探针与所述基因第一ｍＲＮＡ变体的部分核苷酸序列或该变体所对应的ｃＤＮＡ的部分核苷酸序列 互补，第一探针不与所述基因第二ｍＲＮＡ变体的部分核苷酸序列或该变体所对应的ｃＤＮＡ的部分核苷酸序列互补，第二探针与所述基因第一ｍＲＮＡ变体的部分核苷酸序列或该变体所对应的ｃＤＮＡ的部分核苷酸序列互补，和第二探针与所述 基因第二ｍＲＮＡ变体的部分核苷酸序列或该变体所对应的ｃＤＮＡ的部分核苷酸序列互补。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗查尔，
申请(专利权)人：富卡斯吉诺米克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]