本发明专利技术公开了利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法。本发明专利技术所提供的利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法包括以下步骤：通过PCR的方法扩增出一段DNA片段，其包括与微生物染色体上待调控基因原始调控区域上游序列同源的一段含40-3000个碱基的片段、抗性标记基因、人工调控元件文库或是一个具有特定表达强度的人工调控元件、与微生物染色体上待调控基因起始密码子下游序列同源的一段含40-3000个碱基的片段；将该DNA片段电转化入微生物体内，将微生物染色体上待调控基因的原始调控区域替换为人工调控元件文库或是一个具有特定表达强度的人工调控元件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
基因表达调控技术是代谢工程的核心技术之一。目前在改造微生物提高目标产品合成能力时，常用的一种策略是通过质粒过表达的方法对基因的表达进行调控，提高某个或某几个关键酶的活性，从而增强微生物合成目标产品的代谢流量。质粒过表达时，通常使用的都是诱导型启动子(如laC、trc、ara等启动子)来调控基因的表达。然而，这种方法有三大弊端。第一，由于需要添加乳糖、IPTG、阿拉伯糖等昂贵的诱导剂来诱导这些启动子的表达，在生产大宗化学品时使用这些诱导型启动子在经济上是不可行的。第二，基于质粒的表达有很多弊端质粒的维持对宿主细胞会造成很大的代谢负荷，尤其是高拷贝的质粒； 很多质粒的遗传稳定性不好；只有低拷贝数质粒的复制和细胞的繁殖是同步进行的，因此也只有它们在所有的细胞中保持一致的拷贝数；很多化合物的合成需要在细胞中构建出一条复杂的代谢途径，因此需要引入包含多个基因的长DNA片段，而大部分质粒都比较难携带长DNA片段。第三，为了使微生物合成目标产品的代谢流达到最大，必须精确控制合成途径中各个基因的表达强度，使它们达到协同表达的状态。目前广泛使用的诱导型启动子其强度都是固定的，不能满足精确调控基因表达强度的需求。因此，很有必要获得一系列具有不同表达强度的调控元件，能对基因的表达进行精确调控。通过使用具有不同表达强度的人工调控元件，直接在染色体上对基因的表达进行精确调控，可以很好地解决上述的质粒过表达所带来的问题。原核生物主要在转录水平对基因表达进行控制，因此启动子是最主要的调控元件。近些年来，科学家们开发出多种构建组成型启动子文库的技术来对基因表达进行调控(Jens0n，1998，WO 98/07846 ；彼得·鲁戴尔·简森，1999，CN 1233287A ；Alper et al. ,2005, PNAS, 102 :12678-12683 ； Hartner et al. ,2008, Nucleic Acids Res, 36 :e76 ;Rud et al. ,2006, Microbiology, 152 :1011-1019 ；Meynial-Salles et al.，2005，Appl EnvironMicrobiol,71 :2140-2144) 一种技术是通过改造启动子-10和-35区域的间隔序列来控制启动子的强弱(Jenson， 1998，WO 98/07846 ；彼得·鲁戴尔·简森，1999，CN 1233287A)；另一种技术是通过使用易错PCR(error-prone PCR)技术在原始启动子序列上造成随机突变(Alper et al. ,2005, PNAS, 102 :12678-12683).这两种技术均能够获得基因表达强度差异很大的一组启动子文库，这些启动子随后能被从质粒转移到染色体上，从而实现在染色体上对基因表达的调控。 另一种构建启动子文库的方法是利用随机切割的染色体DNA片段。^gram研究小组利用运动发酵单胞菌染色体DNA的Sau3AI酶切片段构建了启动子文库，用于筛选在克雷伯氏菌中能很好表达欧文氏菌内切葡聚糖酶的启动子，从而提高细胞工厂将纤维素转化为乙醇的能力(Zhou et al. ,2001, Appl Environ Microbiol,67 :6-14)。基因的表达强度除了受启动子的调控，还受到启动子上游区序列、信使RNA稳定区序列和核糖体结合位点序列的影响。目前，关于构建启动子上游区、信使RNA稳定区和核糖体结合位点调控元件的报道还比较少。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种利用人工调控元件文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法。本专利技术所提供的利用人工调控元件文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法，包括以下步骤将微生物染色体上待调控基因的原始调控区域替换为人工调控元件文库。所述微生物染色体上待调控基因为微生物染色体上的内源基因和整合到微生物染色体上的外源基因。所述人工调控元件文库为启动子文库、启动子与核糖体结合位点之间的信使RNA 稳定区文库、核糖体结合位点文库、启动子上游区文库中的一种或几种。所述启动子文库为一段含有随机碱基的DNA序列，其包括一个含6个特定碱基或6 个随机碱基的启动子-35核心区域、一个含6个特定碱基或6个随机碱基的启动子-10核心区域、一个在-35和-10核心区域之间的含10-20个特定碱基或10-20个随机碱基的中间区域、一个含特定碱基的启动子上游区、一个含特定碱基的信使RNA稳定区、一个含特定碱基的核糖体结合位点。所述信使RNA稳定区文库为一段含有随机碱基的DNA序列，其包括一个含特定碱基的启动子上游区、一个含特定碱基的启动子、一个在启动子与核糖体结合位点之间的含5-50个随机碱基的信使RNA稳定区、一个含特定碱基的核糖体结合位点。所述核糖体结合位点文库为一段含有随机碱基的DNA序列，其包括一个含特定碱基的启动子上游区、一个含特定碱基的启动子、一个含特定碱基的信使RNA稳定区、一个含6-20个随机碱基的核糖体结合位点。所述启动子上游区文库为一段含有随机碱基的DNA序列，其包括一个在启动子-35核心区域上游的含5-1000个随机碱基的区域、一个含特定碱基的启动子、一个含特定碱基的信使RNA稳定区、一个含特定碱基的核糖体结合位点。所述启动子文库的序列为序列表中的序列1和序列2。所述信使RNA稳定区文库的序列为序列表中的序列9。所述核糖体结合位点文库的序列为序列表中的序列18。所述启动子上游区文库的序列为序列表中的序列17。所述将微生物染色体上待调控基因的原始调控区域替换为人工调控元件文库，还包括以下步骤通过PCR的方法扩增出一段DNA片段，其包括与微生物染色体上待调控基因原始调控区域上游序列同源的一段含40-3000个碱基的片段(作为左同源臂)、抗性标记基因、人工调控元件文库、与微生物染色体上待调控基因起始密码子下游序列同源的一段含 40-3000个碱基的片段(作为右同源臂)。使用同源重组的方法，将微生物染色体上待调控基因的原始调控区域替换为抗性标记基因和人工调控元件文库。所述抗性标记基因为氨苄青霉素抗性基因、卡纳霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、 四环素抗性基因、安普霉素抗性基因中的一种或几种。所述微生物为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色体上待调控基因为大肠埃希氏菌的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)、 1-脱氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)。本专利技术的另一个目的是提供一种人工调控元件的构建方法。本专利技术所提供的人工调控元件的构建方法包括以下步骤将微生物染色体上标记基因的原始调控区域替换为人工调控元件文库，获得一系列具有不同调控强度的人工调控元件。通过测定该标记基因编码蛋白的活性，确定各个人工调控元件的强度。所述微生物染色体上标记基因为微生物染色体上的内源基因和整合到微生物染色体上的外源基因。所述微生物为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色体上标记基因为大肠埃希氏菌的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)。本专利技术的又一个目的是提供一种利用具有特定强度的人工调控元件调控微生物染色体上基因表达强度的方法。本专利技术提供的利用具有特定强度的人工调控元件调本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用人工调控元件文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法，包括以下步骤：将微生物染色体上待调控基因的原始调控区域替换为人工调控元件文库。所述微生物染色体上待调控基因为微生物染色体上的内源基因和整合到微生物染色体上的外源基因。所述人工调控元件文库为启动子文库、启动子与核糖体结合位点之间的信使ＲＮＡ稳定区文库、核糖体结合位点文库、启动子上游区文库中的一种或几种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，李清艳，卢焦，赵婧，
申请(专利权)人：天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：12
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