新型表达载体制造技术

本发明专利技术一般涉及表达载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。具体而言，本发明专利技术提供了表达载体和／或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。更具体而言，本发明专利技术提供了包含可转录多核苷酸的表达载体，其中包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的ＲＮＡ元件的编码核苷酸序列。本发明专利技术特别提供用于鉴定和分析顺式和反式调节序列／因子的新载体，以及特别用于药物筛选和药物发现的载体和遗传改变的细胞系或生物体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及载体及其在基因表达或基因调节分析中的用途。更具体而言，本专利技术提供了表达载体和/或报道载体，其蛋白质表达动力学具有改善的时间相关的启动子活性。本专利技术特别提供用于调节基因表达、鉴定和分析调节序列的新型载体和细胞系，用于治疗性干预人类疾病及药物筛选的新的靶标和试剂。
技术介绍
在本说明书中按作者引用的出版物的参考文献细节汇集于说明书末尾。此处参考的现有技术，包括任何一份或多份现有技术文件，不应视为是认可或提示该现有技术属于当前技术水平。重组DNA技术日益精深，极大促进了医疗及相关健康领域的研究和开发。利用表达载体研究基因表达是特别重要的研究领域。然而迄今为止，缺少合适设计的载体限制了对基因表达的实时分析。报道分子分析可以了解是什么控制目的基因表达，例如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA结合蛋白质、信号转导途径以及特定的刺激物。此外，报道分子分析可用于鉴定基因调节因素，作为治疗性干预人类疾病的新靶标。报道分子测定可潜在用于筛选能够改变基因表达的药物。然而，现有报道分析系统所需费用和时间，加之过长的反应时间，限制了其应用。基因组序列一般在编码区上游具有启动子序列，决定细胞的转录特异性和可诱导性，从而影响蛋白质产物的表达水平。特定的序列元件一般富含核苷酸碱基A和U，并常位于基因的3’-UTR，影响mRNA的稳定性，因而影响蛋白质产物的表达水平。RNA结合蛋白质与某些mRNA序列结合，从而调节mRNA稳定性和蛋白质表达。其它序列调节翻译效率。报道基因分析常用于研究调节转录的DNA序列。这些序列一般位于转录起始位点5’端的启动子区域。将上述DNA元件克隆到报道质粒的相似位点进行测试，使其驱动和/或调节转录，从而表达报道蛋白质。报道蛋白质应该可以同内源性蛋白质相区分，并易于定量。使用了多种报道蛋白质，最常用的是萤光素酶、氯霉素转移酶(CAT)以及β半乳糖苷酶(β-gal)。利用合适的分析定量报道蛋白质，经常相对于普通启动子(例如SV40启动子)驱动的对照报道分子的水平而表示。对照报道分子必须可以与待测报道分子相区分，并包含于与待测载体共转染的独立载体中，用于控制转染效率。上述分析根据的前提是，细胞按比例摄取等量的两种载体。质粒载体的瞬时转染最常使用。上述分析用于鉴定启动子区或启动子内部特定元件。另外用于研究启动子或调节元件对各种刺激物的反应。某些应用将报道构建体或转染的细胞置于生物体中，在体内研究启动子的功能。报道分子分析的另一应用在于研究或测定特定启动子上游的信号转导途径。例如，可以将依赖有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)转录的启动子连接到报道构建体，用于测定细胞中MAPK活化的水平(或MAPK依赖的转录)。该技术可与多种信息性启动子或增强子利用，并应用于细胞或活生物体，例如转基因小鼠。例如，可以使用光子成像仪测定在包含与目的启动子相连的萤光素酶报道分子的整个小鼠中萤光素酶报道分子的活性(Contag等人，1997)。萤光素酶是迄今最常用的报道分子体外分析系统。双萤光素酶分析(DLA；Promega，Madison，WI，USA)是对其它萤光素酶系统的改进，即待测和对照报道分子可以基本上在同一分析中进行测定。下文提供当前使用的典型DLA方案的实例将推定的启动子元件克隆到萤火虫萤光素酶报道基因上游，使之驱动其表达。将该质粒与包含SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶基因的对照质粒一起瞬时转染细胞系。～2-50％的细胞摄取质粒并表达报道分子～3天。表达动力学包括在最初24小时升高，积累萤光素酶蛋白质，随后～48小时下降，细胞内质粒数目减少。转染24-48小时以后，收集细胞并裂解。细胞裂解物与萤火虫萤光素酶特异性底物温育，使用发光计测定活性(发光)(96孔板或单个样品)。然后加入失活萤火虫萤光素酶但允许肾海鳃萤光素酶发光的另外底物。从而测定肾海鳃萤光素酶活性。萤火虫萤光素酶活性水平不仅依赖于启动子活性，而且依赖于转染效率。根据DNA数量、DNA制剂的质量和细胞状态，其变化很大。共转染的对照质粒(SV40启动子驱动的肾海鳃萤光素酶)用于修正这些变数，依据的前提是，肾海鳃萤光素酶活性与细胞摄取的萤火虫萤光素酶质粒的数量成正比。数值可以表示为萤火虫萤光素酶活性/肾海鳃萤光素酶活性。双萤光素酶分析的缺点如下(i)试剂昂贵、易变质，必须新鲜制备。(ii)该分析一般包括细胞裂解物的制备，耗时并引入误差，例如裂解期间的细胞损失、移液误差、残留缓冲液/培养基使体积改变。(iii)每个样品只得到细胞群体总活性的一个数据点。不能获得表达报道分子细胞的百分比以及每一细胞的表达量的有关信息。(iv)转染对照(肾海鳃)并不总能修正转染效率的极大变动，这是因为a.某些DNA制剂转染/表达较差(也许由于超螺旋DNA的比例减少)，但并不引起共转染的对照质粒的数量相应下降。b.有证据表明，这两个质粒的启动子之间串扰(cross-talk)，使对照报道分子的活性有赖于共转染的构建体，例如肾海鳃萤光素酶在与包含强启动子的质粒共转染时似乎表达最高。启动子之间的干扰若不加防止，也限制表达待测与对照两种报道分子的单个质粒的使用。c.转录和转录后研究常用于测定各种刺激物(例如PMA、EGF、激素)的活化/抑制。不巧的是，SV40、RSV、TK以及可能许多其它普遍表达的启动子可由多种刺激物活化。由于这些启动子用于驱动转染的对照报道分子(肾海鳃)的表达，这些报道分子不能真实反映经上述处理后的转染效率。(Ibrahim等人2000)。d.萤火虫与肾海鳃萤光素酶蛋白质、也可能mRNA的半衰期差异使整个系统具有很强的时间敏感性。e.发光迅速减弱，特别是肾海鳃萤光素酶，要求测定时间绝对精确。f.萤光素酶蛋白质和mRNA相对较长的半衰期可有效掩盖转录的时间变化(例如在各种刺激物或处理以后)。在现有的转录后/mRNA稳定性报道分子分析中，将据认为影响mRNA稳定性的候选元件克隆到由组成型启动子例如SV40或RSV驱动的报道载体(例如萤火虫萤光素酶)的相应区域。假定相对于空载体(无目的元件的相同载体)的表达变化为改变mRNA稳定性的结果。与初步描述的转染分析相同，将转染对照质粒(例如，组成型启动子(例如SV40或RSV)驱动的肾海鳃萤光素酶)共转染，以修正转染效率。这些分析具有以下其它缺点(i).现有载体并未设计用于转录后研究，也未意在阻断转录。(ii).这些方案的目的是研究候选mRNA元件的转录后影响。然而，这些元件还可以在DNA水平影响报道分子的转录。此外，由于并未使用目的基因的内源性启动子，所观察到的任何转录影响可能几乎没有生理意义。存在用于研究mRNA稳定性的系统，但涉及直接测定mRNA，而非报道蛋白质。由于定量mRNA的方法具有工作量大的特点，上述系统相当耗时。例如，一种系统利用c-fos启动子通过短暂的突发转录(abrief burst of transcription)响应血清诱导。将推定的不稳定性元件克隆到β球蛋白(BBB)构建体的3-UTR，该构建体在血清诱导型启动子(c-fos)控制下表达非常稳定的mRNA。转染的细胞(一般是NIH 3T3细胞)首先经受血清饥饿，然后接触包含血清的培养基。转录反应的短暂特性使得报道分子mRNA降本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含可转录多核苷酸的表达载体，其包含调节相应于所述可转录多核苷酸的转录本稳定性的ＲＮＡ元件的编码核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J戴利，
申请(专利权)人：基因流股份有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]