检测核酸中杂化作用的方法技术

本发明专利技术公开了通过杂化作用检测靶核酸的方法，在该方法中ａ）用至少一种其端部之一和固相连接的核酸探针，与具有靶核酸序列或与其互补的序列的核酸探针进行杂化作用，该序列以短核酸序列侧接在３’－端位上并以与其互补的核酸序列侧接在５’－端位上，这构成ＤＮＡ双链和由此构成的裂解模块，该模块可以被双链特异性的核酸酶所裂解且具有的核酸探针在另一端具有一个标记；ｂ）利用至少一种双链特异性的核酸酶进行至少一次处理，和ｃ）确定经步骤ｂ）后连接在固相上的标记的比例。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

，并且首先是在如临床诊断或工业活性化合物研究等的那些要参照自动化方法来保证高的样品处理量的领域内，需要找到能用以实现测量结果的标准化而毋需高昂的校准测量过程。用于检测核酸中杂化作用的现有技术的体系，以及其用于表达分析方面强烈地依赖于用作核酸试样或作为合成核酸试样模板的待测mRNA的完整性。这些体系首先由于标记要杂化的未结合固相的核酸(核酸试样)而变得易于错误解释，这就会弄错所有的测量结果。本专利技术的方法可用于表达分析，并且在这分析过程中未标记的靶核酸与连接固相的探针的序列特异性杂化作用可以定量确定，而并不依赖于核酸试样的完整性。能在表面上检测不同核酸探针的最大数值是受限于光学和“微流控”的面积中的物理限制，而本专利技术公开了一种使用某种体系的DNA阵列，该体系中不受因光学和“微流控”面积的物理限制而受到限制，而且和现有技术中的体系相比较，特定面积上可检测的核酸试样可以明显提高。一优选实施方式，公开了一种用于检测在固相结合的核酸探针上发生杂化作用的方法，该方法通过使用固相结合的标记过的探针而实现了测量结果的标准化，使用未标记的核酸试样或靶核酸并同时在特定点上对不同靶核酸的表达进行分析。本专利技术的固相结合的核酸试样可以是DNA或DNA/PNA嵌合体形式，由于其自身序列而构成分子内的次级结构，该结构可以通过双链特异性的核酸内切酶而进行识别和裂解。本专利技术由于形成分子内次级结构而以双链形式存在的核酸探针的部分基本上是DNA，从而就能保障对双链特异性的核酸内切酶的可达性。由于本专利技术的固相结合的探针-靶核酸与待检测的核酸进行杂化作用，因而分子内的二级结构，并因此双链区会分解，并且不再能通过双链特异性的核酸内切酶进行识别和裂解。非杂化的且固相结合的核苷酸探针能被酶裂解。本专利技术核酸探针的标记部分由于酶的裂解而从表面分离，渗入到周围介质中，并且适当时还可以将其洗去。在紧接着将非杂化的核酸探针进行酶分解后，测定那些杂化过且未被酶平截的核酸探针的荧光团。该方法的信号-本底比只是取决于所用双链特异性的核酸内切酶的质量以及与未杂化的核酸探针的分离完全性，并对应于与用放射性标记的核酸进行杂化作用的信号-本底比。由于不是对确定的核酸试样或靶核酸，而是对固相结合的核酸探针进行标记，所以可以将许多具有不同序列特殊性的核酸探针固定在表面上的特定的面积或特定的点上(点)，这些核酸探针的数量等于所存在的荧光体团数量，因而具有可以根据其激发或发射最大值而从光谱上进行区分的荧光团。本方法的灵敏度可以通过与核酸探针共价连接的荧光体数目而进行提高。除了已知的荧光团外也可以使用部分结合对，如洋地黄毒苷、生物素或其他半抗原用于标记固相结合的探针。特别是结合不同半抗原的分子(免疫球蛋白，链菌抗生物素)是与不同底物特异性的酶共价连结的。这些酶可以是碱性磷酸酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶等。因此可以根据可用的不同半抗原的数目和可用的不同酶共轭体的数目，将任意多的具有不同序列特性的核酸探针固定在表面上的特定的面积或点(点)上。用于与经固定的核酸探针进行杂化作用的核酸试样或靶核酸可以是未经标记的DNA、cDNA、cRNA或mRNA。与传统体系相比，为仅使用部分靶核酸或核酸试样进行杂化作用，这部分是与核酸探针的检测模块互补的，因为在本体系中核酸探针是标记的。所述体系的另一优点是，检测灵敏度并不取决于核酸试样的标记效果，而是只取决于核酸探针的标记。而这就可以更为精确地进行确定。本专利技术的核酸探针如附图说明图1A所示。典型的核酸探针具有以下成分·至少一种官能基团(1)如氨基基团(NH2)、硫醇基(SH)，或是部分结合对如生物素、洋地黄毒苷用以接合到固相。·优选是大于11个C2键长度的间隔模块(2)，且其端部之一与官能基团共价连接。·序列段α(识别和分裂模块)，其长度优选为5-12个核苷酸，由DNA组成并且其3’-端位上共价连接到与固相连结的间隔模块的末端。序列段α含有用于限制性核酸内切酶的识别序列。·序列片段β(检测模块)，其长度优选为12道30个核苷酸，其3’-端位上共价连接到序列片段α(识别和分裂模块)的5’-端位并且它可以是DNA、RNA或PNA。序列片段β是构成分子的部分该分子，它在适当反应条件下可作为探针和待检测的靶核酸形成异源双链体。序列片段β的核苷酸和/或糖-磷酸盐主链或假肽主链(Pseudopeptidrückgrat)可以和荧光团共价连结。·序列片段α’(识别和分裂模块)，其由DNA组成并且其3’-端位与序列片段β的5’-端位共价连接。片段α’的序列互补于对应的序列片段α。·间隔模块(3)，其优选具有大于11个C2键的长度并共价连接到序列段α’的5’-端位。·适当时还有一分支模块(未示出)，其共价连接到间隔模块(3)的端部且其不与序列片段α’的5’-端位连接。在该分支模块的各端上可以连接有直至n个的其他分支模块，从而获得3n末端的最大数，同时在各个末端·连接有荧光团(4)或是部分结合对(生物素或洋地黄毒苷)。探针通过单元(1)与固态基体连接。此外，该固体表面可以是平整表面，也可以是凸的或是凹的，还可以是纤维或是无机、有机材料制成的微米或纳米颗粒。以下将连接到这种固态基体上的本专利技术的核酸探针称为DNA阵列。序列片段α和α’是彼此互补的并且可以在适当的条件下形成双链区，也就是双链体α-α’(参见图1B)。通过分子内的双链体形成作用而生成的发夹结构，对于单链构象的热动力学是有利的。于是，在低于序列片段α或α’的平衡熔融温度Tm的温度下，分子只以具有分子内双链体α-α’的发夹结构存在，而该结构通过限制性核酸内切酶而以序列特异性方式分裂。在利用限制性核酸内切酶进行裂解后，单元(1)，(2)和适当时还有少量的单元(α)的核苷酸还是保持与固相连接。探针的标记单元会渗入周围的介质，并适当时将其洗去。通过与靶核酸杂化，该核酸可以是RNA或DNA并且其序列是与序列片段β的序列互补的，探针是以与核酸试样构成的双链体形式部分存在。在这种情况下序列片段α和α’以单链形式存在，并不能通过限制性核酸内切酶或其他双链特异性的核酸酶裂解。与分子内双链体α-α’相比，为保证由核酸试样和序列片段β所组成的异源双链体能具有足够的稳定性，序列片段β的平衡熔融温度Tm(β)必须要高于序列片段α或α’的；也就是Tm(β)＞Tm(α)。理想的是，由核酸试样与序列片段β所构成的异源双链体的平衡熔融温度Tm(β)要高于分子内双链体α-α’的平衡熔融温度10℃-25℃。和带有相同靶核酸的线形核酸探针相比，可以构成次级结构的核酸探针具有更高的序列特异性。不具有错配碱基的核酸探针/靶核酸双链体和具有错配碱基的核酸探针/靶核酸双链体的平衡熔融温度差ΔTm，在能构成次级结构的核酸探针中约为在线形核酸探针中的两倍高。本专利技术的方法可优选用于多重分析。在这种情况下，将n个不同的核酸探针固定在相同面积上，且这些核酸探针本身在序列片段β中，在荧光团的激发光谱和发射光谱内，以及适当时也在包含于序列段α和α’中的对于限制性核酸内切酶的识别序列方面是可以相互区分的。用印刷法将含有等摩尔量的这些n个不同核酸探针的水溶液沉积并固定在固体表面上。这些面积可以是DNA阵列上的“点”或者是微米或纳米颗粒的表面。这样，就可以同时分本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过杂化作用检测靶核酸的方法，其特征在于，在该方法中ａ）使用至少一种以其端部之一和一固相连接的核酸探针进行杂化作用，其中核酸探针是靶核酸序列或与其互补的序列，该序列以在短核酸序列侧接在其３’－端位并以与该核酸互补的核酸序列侧接到５’ －端位上，该核酸构成了一条ＤＮＡ双链并由此构成裂解模块，该模块可以被双链特异性的核酸酶所裂解并具有的核酸探针在另一端部具有一个标记；ｂ）利用至少一种双链特异性的核酸酶来进行至少一次处理，和ｃ）确定经步骤ｂ）后连接到固相上的标 记的比例。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗查尔斯，
申请(专利权)人：富卡斯吉诺米克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]