间充质干细胞的用途及其制取方法技术

一种间充质干细胞，作为基因治疗的靶细胞，用于转基因药物的表达、储存和释放的载体。本发明专利技术利用病毒载体将把外源性的启动子和目标基因导入间充质干细胞，并使目标基因整合到宿主细胞的基因组中，从而能够稳定内源性表达目标基因而不丢失，以用于基因治疗。本发明专利技术通过转胰岛素基因治疗的实验充分验证了间充质干细胞可作为表达、储存和释放目标药物的储库使用，具有高效、安全和可靠等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种转基因表达、储存和释放载体，尤其涉及一种用于转基因药物的表达、储存和释放的间充质干细胞及其制取方法，以其作为载体用于制备转基因药物。
技术介绍
目前，糖尿病的治疗方式和药物多种多样。在此诸多方法中，胰岛细胞移植是治疗糖尿病的首选方案，但胰岛移植不仅操作过程复杂，而且胰岛来源有限，远远满足不了为数众多的糖尿病患者的需求。近年来，干细胞疗法逐渐成为研究的热点，试图通过干细胞移植来修复病变的胰岛组织，使其重现分泌胰岛素的功能，或将干细胞直接诱导分化或基因转染为产生胰岛素的细胞(CN101300343A，CN102391982A, CN101240262A, CN102618491A, CN101432425A)，然后移植到生物体，通过所产生的胰岛素来控制血糖水平，达到治疗糖尿病的目的。田军等人采用了胰岛素基因转染上皮细胞的技术，成功控制了糖尿病鼠的血糖水平(Molecular Therapy, 2008, 16, 1146 - 1153)。但是,之后进行的跟踪实验证明，使用该技术的受试动物成活率较低，难以实际应用。虽然目前将胚胎干细胞分化为产生胰岛素的细胞已获得了初步的成功，但利用胚胎干细胞移植治疗糖尿病面临着细胞来源有限、应用有悖伦理和移植后诱发肿瘤形成风险和免疫排斥等诸多实际问题。利用骨髓、脐带和脂肪等来源的成体干细胞移植，来修复病变的胰岛细胞，以期重 现其产生胰岛素的能力，目前仍正在试验研究中，具体疗效还有待于进一步的判定。利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗，这种方法称为基因疗法(Gene therapy)。基因疗法是治疗某些代谢疾病和遗传疾病的一种重要手段。其中载体和受体细胞(靶细胞)是决定基因治疗效果的关键因素。用于基因治疗的载体有多种，其中病毒载体因其介导基因转染率高，靶向性好，已成为基因治疗中应用广泛基因运载工具。靶细胞的选择也是基因治疗的重要环节，如:血管内皮细胞、骨髓基质细胞、角阮细胞和胶质细胞。由于伦理等问题，目前应用与基因治疗的细胞仅限于人的体细胞，现在经常使用的体细胞包括:骨髓细胞、成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、淋巴细胞和生殖细胞等(http://fzswx.fmmu.edu.cn/fzswx/knowledge/knowledge01.asp zsdBianhao=110203)o由于获取这些细胞可能受年龄和性别的限制，或可能对机体造成损害，或其免疫原性等原因，其应用受到限制。因此，寻找合适的、适用性强的、能够用于基因治疗的靶细胞仍需要不断探索和研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种间充质干细胞，作为基因治疗的靶细胞，用于转基因药物的表达、储存和释放的载体，以提高生物体的成活率。本专利技术的又一个目的在于提供一种间充质干细胞，作为糖尿病基因治疗的靶细胞，用于转胰岛素基因药物的表达、储存和释放的储库，既能控制血糖水平，亦显著提高生物体的成活率。本专利技术的再一个目的在于提供一种用于转胰岛素基因药物的表达、储存和释放的储库的间充质干细胞的制取方法。本专利技术所称的“间充质干细胞”是指一种源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。本专利技术中，其包括但不仅限于毛囊间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、胚胎干细胞来源的间充质干细胞和诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。这些间充质干细胞可直接来源于自体，也可来源于异体，以及通过体外大规模扩增的方式培养获得。毛囊是皮肤的附属器之一，起源于表皮和间充质间相互作用。毛囊中除了含有角朊干细胞和黑色素干细胞外，还含有间充质干细胞。这些毛囊来源的间充质样干细胞不仅能够自我更新，还能够分化为骨、软骨、脂肪、血管平滑肌细胞和神经细胞等。研究表明毛囊干细胞移植后能够参与血管新生、皮肤重建和神经修复。毛囊来源丰富，取材方便。获取毛囊几乎不受年龄和性别的限制，也基本不会对机体造成任何损害。另外毛囊的免疫原性低。研究表明同种异体移植的毛囊可在人体内长期存活，且未见致瘤性。因此，本专利技术优先选择从毛囊中分离获得的毛囊间充质干细胞作为基因治疗的靶细胞，以从根本上解决利用胚胎干细胞或其它成体干细胞开展上述研究时所面临着的细胞来源有限、获取不便、有悖伦理和诱发肿瘤形成等实际问题，不仅拓宽干细胞的研究领域，又具有实际应用潜能。本专利技术所称的“糖尿病”包括医学上所定义的I型糖尿病和II糖尿病。本专利技术所称的“生物体”指人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如:狗、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵 羊、山羊、鹅和鸡等。给予治疗的“生物体”优先选择哺乳动物，尤其是人。本专利技术所称的“储库”指包括全部或部分的目标基因序列，能够表达并储存目标多肽或蛋白质，并使这些多肽或蛋白质在使用或未使用激动剂的作用下能主动或被动对外释放的载体。本专利技术所称的“转胰岛素基因药物的表达、储存和释放的储库”指包括全部或部分的胰岛素基因序列，能够表达并储存胰岛素、前胰岛素(pro-1nsulin)以及含有胰岛素全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质，并使这些多肽或蛋白质在使用或未使用激动剂的作用下能主动或被动对外释放的载体。那些与源自生物体的各种天然胰岛素的核苷酸和氨基酸序列具有50%以上同源性的，且能执行胰岛素生物学功能的聚核苷酸、多肽和蛋白质均包括在本专利技术所称的“转胰岛素基因药物”中。一种转胰岛素基因药物的表达、储存和释放的储库，其含有前胰岛素编码基因(hppl4)、自发聚合蛋白(FM)编码基因以及酶切位点(FCS)和标记基因。本专利技术所称的“激动剂”为能使储库中所储存的多肽或蛋白质脱离储库的化学键(如:易于水解或酶解的化学键)、分子、聚合物或组合物。在具体应用中，该激动剂与所储存的多肽或蛋白质共存于储库中，或单独加入，或以组合物加入，或与其它分子共同作用等方式，使所储存的多肽或蛋白质脱离储库。本专利技术所称的“培养液”或“培养基”是指以DMEM (Dulbecco's Modified EagleMedium)、DMM-F12、EGM (Endothelial Growth Medium)、KGM (Keratinocyte GrowthMedium)、IMDM (Iscovei s Modified Dulbecco’s Medium)、MEM (Minimum EssentialMedium)和EBM (Eagle’s Basal Medium)中的一种或多种为基本培养液(基)，并含有一种或多种生物因子的混合物。本专利技术所称的“生物因子”为胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)、喊性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factors, bFGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、血管表皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor, VEGF)、血小板源性生长因子(Platelet deri本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞，作为载体用于制备转基因药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晋宇，吴春铃，赵桂芳，刘菲琳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：