结核分枝杆菌海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2的表达纯化及与磷酸复合体的晶体三维结构制造技术

本发明专利技术涉及结核分枝杆菌海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2的表达、纯化和结晶方法；以及海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2硒代蛋白质的载体构建、表达和纯化方法，具体地说就是将OtsB2的29位和133位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，在大肠杆菌B121(DE3)中使用特殊培养基大量表达硒代蛋白OtsB2；以及海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体的结晶方法；以及海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2在大肠杆菌中的表达、纯化、结晶优化方法以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应用。
技术介绍
结核分枝杆菌的全球控制当今面临着重大挑战，WHO报道，目前世界上二十多亿人口已感染结核分枝杆菌，造成每年近200万人口死亡。尤其是非洲等出现的结核分枝杆菌和艾滋病毒的合并感染(结核/艾滋病毒)增加了结核分枝杆菌的易感人群，以及在所有区域出现的耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核病，使疾病控制活动更趋复杂、更为艰巨。目前抗结核药物主要针对活性结核分枝杆菌，通过抑制其细胞壁，能量ATP和DNA的合成，针对休眠期的药物靶点研究甚少。目前认为，结核分枝杆菌细胞壁中的海藻糖是保护结核分枝杆菌度过干旱，炎热，缺氧等极端环境的必需二糖。Mladen Tzvetkov等人在2003年发表文章认为结核分枝杆菌体内有三条途径合成海藻糖，通过对每个途径中关键酶的基因敲出实验证明OtsAB通路(将葡萄糖和葡萄糖六磷酸转化为海藻糖)是海藻糖合成的至关重要的途径，对于结核分枝杆菌的生存具有不可缺失性，并且被证明存在于多种细菌、酵母、真菌、昆虫和植物中。在这条通路中参与合成海藻糖的酶有两种，一种是海藻糖-憐酸合成酶(trehalose-phosphatesynthase, TPS or OtsA)另一种是海藻糖-憐酸憐酸酶(trehalose-phosphatephosphatase, TPP or OtsB)。OtsA 主要用来催化将 UDP-葡萄糖中的葡萄糖基团转移到葡萄糖-6-磷酸中，产生海藻糖-6-磷酸和UDP，OtsB的功能是将磷酸基团脱去产生海藻糖。在OtsB基因的同源片段中，只有沉成2具有生理功能。OtsB2即海藻糖-6-磷酸磷酸酶，被证明对于结核分枝杆菌的生长不可缺失，并且在哺乳动物和人中不存在同源基因，是一种 理想的药物靶点。目前通过解析靶点蛋白质结构，可以对开展针对性的药物设计有重要帮助，因此揭示结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2对展开药物设计以及功能研究具有重价值。另夕卜，以往研究中结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2未见报导在细菌中获得表达纯化和结晶，能够获得细菌表达纯化的蛋白结晶对进一步研究海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的功能以及开展药物筛选工作具有重要帮助，可以大大节约时间以及大大降低工作成本和劳动强度。
技术实现思路
本专利技术涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的表达、纯化和结晶优化方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2硒代蛋白质的载体构建、表达和纯化方法，具体地说就是将29位和133位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，在大肠杆菌B121 (DE3)中使用特殊培养基大量表达硒代蛋白OtsB2 ；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体的结晶方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应用。第一方面,本专利技术提供了一种在原核表达体系中，构建可溶性表达载体的方法。其中所述标签蛋白选自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特异性抗体,优选地使用His标签，其他标签均不能得到可溶性表达蛋白；所述载体含有卡那霉素选择性标记基因。本专利技术优选使用大肠杆菌的原核表达体系(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌中或者使用其他的真核生物细胞进行表达)对目的蛋白以His融合蛋白的方式进行表达。第二方面，本专利技术提供了表达和纯化结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的方法，该方法包括:构建融合了标签蛋白基因的编码结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2基因序列的载体，用该载体转化原核或真核细胞，从而表达带有标签蛋白的海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2 ;将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出所述目的蛋白，经过 Thrombin蛋白酶在4_30摄氏度透析酶切过夜,然后将蛋白经过ResourceQ离子交换层析(GE),反挂N1-NTA亲和层析柱,进一步用凝胶排阻层析(GE)等方法分离纯化OtsB2蛋白；用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。优选地，其中透析酶切温度为4-30摄氏度，优选地使用4-10摄氏度，透析缓冲液优选地使用 20-50mMTris (pH8.0)，IOOmMNaCl, ImMDTT ( 二硫苏糖醇)。优选地，其中反挂N1-NTA亲和层析柱优选地补充加入NaCl至终浓度300_500Mm，优选地使用浓缩换缓冲液除去二硫苏糖醇。第三方面，本专利技术提供了一种结晶上述得到的OtsB2蛋白的方法，所述的方法包括:将OtsB2蛋白溶液补加DTT至10禮，再浓缩至10-20mg/V，在4_30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。第四方面，本专利技术提供了一系列晶体优化的方法，包括:分别在在4、16和25摄氏度下，使用Hampton商业试剂盒中的所有条件进行初筛晶体,优选地使用16摄氏度；把长出晶体的池液与Hampton商业试剂盒中每个池液以16:1 1:1的方法混合,优选地使用4: I的方法进行混合，进行再次筛选和优化已有晶体，得到较优质的晶体；通过seeding的方法对蛋白晶体进行优化筛选，优选地，把新点好的平板平衡l_48h后进行seeding实验，更优选地平衡时间10-14h，就得到优质的晶体。第五方面，本专利技术提供了衍射性能良好的OtsB2蛋白质晶体。第六方面，本专利技术提供了 OtsB2硒代蛋白质载体构建的方法，具体是将OtsB2中的亮氨酸突变为甲硫氨酸，增加硒代蛋白质中硒原子信号，提供了一种可以得到海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2的晶体三维结构的方法。优选地，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2中突变的亮氨酸包括29位，133位，172位，285位和379位5个位点，更优选地是29位和133位的亮氨酸突变甲硫氨酸。第七方面，本专利技术提供了得到结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2和磷酸根复合体晶体三维结构的方法，通过筛选生长成型的OtsB2晶体，在晶体中加入底物海藻糖-6-磷酸进行孵育，底物海藻糖-6-磷酸的浓度优选地使用lO-lOOmM，更优选地使用50mM，孵育时间优选地使用6-24h，更优选地使用10_12h。第八方面，本专利技术提供了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构，该结构描述了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的晶体进行X射线晶体衍射，得到上述两种晶体的晶体衍射数据，用所述的蛋白质晶体的衍射数据进一步通过结构解析，构建内海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构。在一具体的实施方式中，提供了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构，其中所述的晶体三维结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌海藻糖?6?磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的晶体三维结构，其中所述海藻糖?6?磷酸磷酸酶OtsB2为海藻糖?6?磷酸磷酸酶OtsB2全长序列的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者海藻糖?6?磷酸磷酸酶OtsB2的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.7埃。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的晶体三维结构，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2为海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2全长序列的编码基因，其中所述晶体三维结构中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐标，或者海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的晶体三维结构中至少40 %氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表I中的坐标的平均根方差小于或等于1.7埃。2.根据权利要求1所述的海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的晶体三维结构，其中所述结核分枝杆菌菌株为H37Rv。3.根据权利要求1或2所述的结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的晶体三维结构，其中所述的晶体具有P2(l)2(l)2(l)的空间群，晶胞参数为约:a = 42 埃，b = 89 埃，c = 105 埃，α = β = γ = 90。。4.根据权利要求1或2所述的结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的晶体三维结构，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsBJ^N端结构域包括β折叠1，即包含从第-2位的Asp到第I位的Val的氨基酸区段，β折叠2，即包含从第16位的Ala到第20位的Asp的氨基酸区段，α螺旋1，即包含从第27位Gln到第37位Val的氨基酸区段，β折叠3，即包含从第39位的Gly到第43位的Phe的氨基酸区段，α螺旋2，即包含从第50位Pro到第57位Leu的氨基酸区段，β折叠4,即包含从第64位的Cys到第68位的Ser的氨基酸区段，α螺旋3，即包含从第71位Ser到第80位Ser的氨基酸区段，β折叠5，即包含从第84位的Leu到第88位的Val的氨基酸区段，α螺旋4，即包含从第94位Arg到第100位Asp的氨基酸区段，β折叠6，即包含从第104位的Thr到第106位的Val的氨基酸区段，α螺旋5，即包含从第109位Leu到第111位Glu的氨基酸区段，β折叠7，即包含从第112位的Val到第116位的Thr的氨基酸区段。其中由β折叠3, β折叠4, β折叠5, β折叠.6，β折叠7组成的平行的β片层组成了 N端结构域的中心骨架，β折叠1，β折叠2组成的小的平行的β片层在一侧垂直于这个中心骨架。其中α螺旋1，α螺旋5与β折叠.1，β折叠2组成的小的平行的β片层在这个中心骨架的一侧，α螺旋2，α螺旋3，α螺旋4，在这个中心骨架的另一侧。其中C端结构域包括α螺旋6，即包含从第121位的Met到第123位的Gln的氨基酸区段，α螺旋7，即包含从第127位的Ala到第132位的Gly的氨基酸区段，β折叠8，即包含从第141位的Gln到第147位的Asp的氨基酸区段，α螺旋.8，即包含从第168位的Ala到第178位的Arg的氨基酸区段，β折叠9，即包含从第181位的Ile到第184位的Leu的氨基酸区段，α螺旋9，即包含从第189位的Leu到第195位的Arg的氨基酸区段，β折叠10，即包含从第202位的Trp到第205位的Gly的氨基酸区段，β折叠11，即包含从第210位的Glu到第213位的Ala的氨基酸区段，β折叠12，即包含从第216位的Gly到第220位的Gln的氨基酸区段，α螺旋10，即包含从第222位的Asp到第243位的Gly的氨基酸区段，β折叠13，即包含从第249位的Val到第253位的Lys的氨基酸区段，β折叠14，即包含从第256位的Gly到第260位的His的氨基酸区段，α螺旋11，即包含从第267位的Asp到第283位的His的氨基酸区段，β折叠15，即包含从第287位的Val到第289位的Thr的氨基酸区段，β折叠16，即包含从第294位的Ile到第296位的Leu的氨基酸区段，α螺旋12，即包含从第305位的Gly到第314位的His的氨基酸区段，β折叠17，即包含从第324位的Val到第329位的Gly的氨基酸区段，α螺旋13，即包含从第332位的Ile到第341位的Val的氨基酸区段，β折叠18，即包含从第346位的Val到第350位的Val的氨基酸区段，β折叠19，即包含从第364位的Phe到第366位的Leu的氨基酸区段，α螺旋14，即包含从第369位的Pro到第383位的Leu的氨基酸区段。其中β折叠8, β折叠9, β折叠10, β折叠11, β折叠12, β折叠17, β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层，构成了 C端结构域的核心骨架结构，β折叠13，β折叠14，β折叠15和β折叠16组成了反平行的β的片层，构成了 C端结构域的另一个小的核心骨架结构。其中这两个由反平行的β的片层构成的核心骨架结构近似于相互平行。其中α螺旋10和α螺旋11分布在β折叠13，β折叠14，β折叠15和β折叠16组成了反平行的β的片层的一侧，但位于远离于β折叠8，β折叠9，β折叠10，β折叠11，β折叠12，β折叠17，β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层的方向上。在β折叠8，β折叠9，β折叠10，β折叠11，β折叠12，β折叠17，β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层的两侧，一边上分布着α螺旋12和α螺旋13，另一边分布着α螺旋7，α螺旋8，α螺旋9和α螺旋14，由此组成了典型的α β α的结构，其中结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根结合后的晶体三维结构及其类似，其中结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体俯视图和侧...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，单珊，杨诚，刘祥，娄智勇，孙玉娜，刘婷，姚利娜，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：