用于制备流感病毒的永久人细胞系制造技术

本发明专利技术涉及借助永久人羊膜细胞制备基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜细胞在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备流感病毒的永久人细胞系本专利技术涉及借助永久人羊膜细胞(Amniozytenzelle)制备基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜细胞在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。接种疫苗是卫生部门采取的最重要的措施以防止因每年的流感疫情引起的疾病。疫苗的成功使用取决于是否能从稳定和容易处理的来源中尽可能快地获得足够大量的接种材料如杀死的病毒。疫苗的快速发展和它们的充足供应对于与许多人和动物疾病的斗争是至关重要的。由于疫苗生产的延误和定量损失，在与疾病爆发抗争时很能会出现问题。因此，最近的努力是在细胞培养液中培养病毒以用作疫苗。到目前为止，所获得的流感疫苗是在孵化的鸡胚蛋中制备的。必须证实这些鸡卵未被某些病毒和细菌污染。这些所谓的“无特异性病原(SPF) ”鸡卵均可市售获得。虽然已证实了鸡卵非常适用于动物和人病毒的繁殖，但是鸡卵在疫苗生产方面具有一些劣势。因为生产每剂量的常规疫苗需要一个鸡卵，所以在例如出现大规模流行病时，疫苗生产用的鸡卵需求量则很高。鉴于鸡卵的供应有限，需要提前约一年的时间准备足够量的鸡卵。此夕卜，还存在对鸡而言高度致病性的流感亚型，因而在大规模流行病的情况下可能出现鸡卵供应短缺。另外，生产过程是非常昂贵和费时的。在鸡卵中生产疫苗的另一个缺点是这些疫苗通常包含鸡蛋清，在一些患者身上可能会出现过敏反应。此外，不同于天然存在病毒的亚群的可能选择需要备选的宿主细胞系统。相比鸡卵，基于细胞培养的用于流感疫苗生产的细胞总是可以获得的。它们可以深冻储存，并且在任何需要的时候短时间解冻所需量以及进行繁殖。因此可以在任何需要的时间点开始疫苗的生产。在出人意料的高需求或意想不到的新病毒株大规模传播的情况中，可以短期提供相应的疫苗。借助细胞培养的生产过程实现了在限定的受控条件下于封闭标准化系统中生产用作疫苗的病毒 。成品流感疫苗由于受控的生产方法而无需添加抗生素就可以获得。由于实现了完全不依赖鸡卵制备细胞培养-流感疫苗，如此制备的疫苗不包含蛋清，从而不会由于鸡蛋清的不耐受而在患者中引起过敏反应。目前主要有以下三个细胞系用于制备流感疫苗:人PER.C6细胞、狗肾细胞(MadinDarby Canine Kidney) (MDCK)和长尾猴-肾细胞(Vero)。此外，目前开发了鸭_视网膜-细胞系(AGE1.CR)和胚胎鸟类(embryonale Vogel)-干细胞系。在哺乳动物细胞中制备疫苗虽然可以替代基于鸡卵制备疫苗，但是这些细胞的生长需要血清和/或附着在固定的载体上。所述这些加剧了在所述细胞中制备疫苗的难度并增加了成本，这是因为出于安全原因考虑必须完全分离血清，并且在固定载体上的生长是受限的，从而导致产量较小。在哺乳动物细胞中制备疫苗的一个优势在于，在细胞培养基中分离和复制病毒不会导致偏离临床野生型的表型的传代-依赖性选择。因此病毒糖蛋白凝血素在自然形式中表达，从而具有改善的特异性和亲和性，并因此在人中实现了细胞-介导的免疫力，其中病毒通过病毒糖蛋白凝血素实现了在将被感染的细胞上的附着并整合入细胞。因此，本专利技术的目的是提供改善的永久人细胞系用于制备基于流感病毒的疫苗。该目的通过权利要求书中限定的主题得以实现。下列示意性示出阐述了本专利技术。附图说明图1A至G示意性示出了，于IOOml振荡瓶中在293SFMI1-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5(.)、在PEM-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5(A)和在SMIF8-培养基中的永久犬肾细胞系MDCK.SUS2(狗肾细胞)( )的培养期间的不同参数的曲线。图1A比较示意性示出了三个细胞系的活细胞数的曲线，图1B示意性示出了细胞系的死细胞数的曲线以及图1C示意性示出了细胞系的存活率的曲线。图1D至G示意性示出了 PH-值(D)、葡萄糖浓度(亮标示)和乳糖浓度(暗标示)(E)、谷氨酰胺(Gln)浓度(亮标示)和铵浓度(暗标示)(F)和谷氨酸(Glu)浓度(亮标示)和丙酮酸盐浓度(暗标示)(G)的曲线。图2示出了柱形图，其给出了在293SFMI1-和PEM-培养基中，流感-病毒株 A/PR/8/34 (HlNl)和 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)的 4 个传代对 CAP-1D5-细胞的病毒滴度(Virustiter)，其作为TCID5tl-值测量。缩写:A/PR293:流感-病毒株A/PR/8/34(HlNl)对 CAP-1D5-细胞，在 293SFMII 培养基中；A/PR PEM:流感-病毒株A/PR/8/34 (HlNl)对 CAP-1D5-细胞，在 PEM 培养基中；A/Urug293:流感-病毒株 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)对 CAP-1D5-细胞，在 293SFMII 培养基中；A/Urug PEM:流感-病毒株 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)对 CAP-1D5-细胞，在 PEM JCID50-值是感染 50% 宿主细胞所需的病毒滴度(以病毒数/ml计)。图3A至F示意性示出了在293SFMI1-(A，B)和PEM-培养基(C，D)中培养永久羊膜细胞CAP-1D5以及在SMIF8-培养基(E，F)中培养永久犬肾细胞MDCK.SUS2时在细胞被流感病毒-病毒株A/PR/8/34感染后以log HA-(凝血素)单位/100 μ I表示的病毒颗粒(Virenpartikeln)量和活细胞数的曲线，其中使用了不同的病毒量，其以MOI (复合感染)值给出:Μ0Ι:0.0025(Λ) ；Μ0Ι:0.025 ( □ ) ;Μ0Ι: 0.25 (〇)。MOI (复合感染)反映了感染性颗粒对靶细胞的数目关系。图4A至D示 意性示出了在IL的生物反应器中于PEM-培养基中培养永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5时的不同参数，其中在114小时后通过流感病毒A/PR/8/34(适应的(adaptiert))发生感染,其中以MOI给出病毒量为0.025。在图4A中示意性示出了活细胞数(▲)、死细胞数(Λ)和细胞的存活率(▲)的曲线。图4B示意性示出了培养基中的病毒颗粒数目(▲)以及谷氨酸盐浓度(Λ )和丙酮酸盐浓度(.)，其中病毒颗粒数目以log HA-(凝血素)单位/100 μ I给出。图4C示意性示出了 pH-值(Λ)的曲线以及图4D示意性示出了感染度(以TCID5cZml表示)。TCID5tl-值以病毒数/ml反映了感染50%宿主细胞所需的病毒滴度。图5A和B示意性示出了柱状图，其反映了历经四次传代(iiber4Passagen)的流感-病毒株 A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、猪流感(A/Swine (H1N2)Bakum/1832/OO)和马流感(A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))在 293SFMI1-和 PEM-培养基中对CAP-1D5-细胞所测量的病毒滴度，其表示为log HA-单位/100μ I㈧或TCID5tl-值(B)。缩写:A/Bris293:流感-病毒株 A/Brisbane/59/2007 对 CAP-1D5-细胞，在293SFMII 培养基中；A/Bris PEM:流感-病毒株 A/fcisba本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.16 DE 102010037008.8;2011.05.13 DE 10201101.基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括: a)使流感病毒接触永久人羊膜细胞， b)培养所述永久人羊膜细胞， c)实现流感病毒的表达，以及 d)从培养基中分离所述流感病毒。2.基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括: a)使编码流感病毒-蛋白的核酸分子接触永久人羊膜细胞， b)培养所述永久人羊膜细胞， c)实现编码流感病毒-蛋白的核酸分子的复制和/或流感病毒-蛋白的表达，以及 d)从培养基中分离编码流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒-蛋白。3.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述永久人羊膜细胞在与流感病毒或编码流感病毒-蛋白的核酸分子进行接触的时间点处于指数生长期和静止生长期中或处于指数生长期和静止生长期之间。4.根据权利要求1所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在步骤d)中从所述培养基中分离出所述流感病毒通过密度梯度-差速-离心或区带离心实现。5.根据权利要求2所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在步骤d)中从所述培养基中分离所述流感病毒-蛋白通过电泳法或色谱法实现。6.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述永久人羊膜细胞表达腺病毒基因产物ElA和E...

【专利技术属性】
技术研发人员：G希德纳，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：
国别省市：