用于产生具有二触角N-聚糖的重组糖蛋白的细胞系、使用其的方法及重组糖蛋白技术

本发明专利技术涉及具有GnTIVa/b和/或GnTV表达降低的经遗传修饰的细胞系、用于使用所述细胞系产生具有三‑和/或四‑触角N‑聚糖数目减少的N‑聚糖的糖蛋白的方法，及相应的糖蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生具有二触角N-聚糖的重组糖蛋白的细胞系、使用其的方法及重组糖蛋白本专利技术涉及具有GnTIVa/b和/或GnTV表达降低的经遗传修饰的细胞系、用于使用所述细胞系产生具有三-和/或四-触角N-聚糖数目减少的N-聚糖的糖蛋白的方法，及相应的糖蛋白。在过去几年中，治疗性蛋白的发展已经大大加速。然而，特别是对于复杂糖基化的蛋白质，可能难以获得具有有利糖基化模式的蛋白质。这通常导致次最优的药理学性质(诸如例如减少的血清半衰期或增加的免疫原性)。产生重组糖蛋白的一个困难是由于翻译后修饰(特别是糖结构)中的变化导致的产物的潜在异质性。这可能导致不同生产批次之间的产物质量不一致。糖基化是最常见的翻译后修饰。几乎所有的生物技术药物都需要被正确地糖基化以展现最佳的治疗效果。通常，糖基化是指糖类与蛋白表面的共价连接，其中糖类与天冬酰胺残基连接产生N-连接的聚糖(N-聚糖)，或与丝氨酸残基或苏氨酸残基连接产生O-连接的聚糖(O-聚糖)。由于附接的聚糖在单糖顺序、分支模式和长度(微观异质性)方面可能不同，所以糖基化模式在不同分子间可能是非常不同的。另外，并非所有糖基化位点都必须完全被占据(宏观异质性)。糖基化影响例如蛋白质的溶解度、它们对蛋白质水解的抗性以及它们与其他蛋白质或蛋白质受体(诸如例如ASGPR(脱唾液酸糖蛋白受体))的结合行为，并因此影响血浆中糖蛋白的半衰期。对于约50kDa以下的小尺寸蛋白质，清除主要经由肾发生。除了蛋白质的尺寸，蛋白质表面电荷也会影响肾脏清除，因为肾脏中高度带电的蛋白质的过滤减少了。对于大尺寸蛋白质，通过特异性和/或非特异性肝摄取的清除主要发生在肝脏中。特异性摄取介体的实例是ASGPR，其与具有末端半乳糖的非唾液酸化的N-连接的糖蛋白特异性结合。由于该受体的作用，与在它们的N-连接的聚糖上具有末端半乳糖残基的它们的非唾液酸化的对应物相比，具有覆盖相邻碳水化合物、半乳糖的末端唾液酸(N-乙酰神经氨酸；NeuAc)的糖蛋白具有高达100倍的增加的半衰期。其他受体与甘露糖、N-乙酰基-葡萄糖胺或岩藻糖特异性结合，并且从系统中清除具有这些末端糖类的糖蛋白。从这个角度来看，由于它决定了治疗性蛋白的药代动力学性质，所以包括高度末端唾液酸化在内的天然或接近天然的N-糖基化模式对于治疗性蛋白是至关重要的。另外，在糖蛋白上具有适当键合的末端唾液酸降低了糖蛋白的免疫原性。获得接近天然糖结构和高度唾液酸化的最重要的策略是在能够将哺乳动物样糖结构与蛋白质连接的哺乳动物细胞系(例如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞))中产生重组蛋白质。然而，非人哺乳动物细胞系通常缺乏所需的酶以催化唾液酸的2,6-键合，并因此只能催化2,3-键合。此外，除了唾液酸之外，它们还通常将N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc)与聚糖连接，所述聚糖是一种人类中不合成的糖并因此在注射时在人类中产生免疫原性。因此，更好的策略将是从如CAP细胞(来源于人羊水细胞)或HEK293细胞(来源于人胚胎肾细胞)的人类细胞系产生治疗性蛋白。然而，在发酵期间从人类细胞系分泌的治疗性蛋白的唾液酸化通常是不完全的。因此，在哺乳动物细胞中的唾液酸转移酶(例如β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)或β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4))的额外表达可能有利于增加治疗性蛋白的唾液酸化并因此增加血清半衰期。有趣地是，人血清蛋白主要是2,6-唾液酸化的，并且通常只有三-和四-触角N-聚糖中的另外分支是2,3-唾液酸化的。在用牛ST6Gal1酶进行的体外研究中揭示了这一现象的原因。特别地，可以证明这种唾液酸转移酶将NeuAc非常低效地添加至N-聚糖的第三和第四分支，特别是至Galβ1→4GlcNAcβ1→6Manα1→6分支(图2)。与这些研究相一致的是，显示与ST3Gal4的表达相比，ST6Gal1的过表达导致复杂N-聚糖的较低程度的唾液酸化。这一现象的原因是四触角N-聚糖的第三和第四触角的特征在于不同的糖苷键，并且在空间上是不同的。因此，它们显示出对ST3Gal4和ST6Gal1酶的不同底物可用性。因此，Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3臂和Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6臂优先通过2,6-连接的唾液酸被唾液酸化，而Galβ1→4GlcNAcβ1→4Manα1→3臂和Galβ1→4GlcNAcβ1→6Manα1→6臂是2,3-唾液酸化作用的优选靶标。与从人血清血浆纯化的它们的对应物相比，在发酵期间从哺乳动物细胞系分泌的治疗性蛋白主要展现出更高程度的三-和四-触角N-聚糖结构。与上述研究一致，ST6Gal1的额外过表达不产生完全唾液酸化的治疗性蛋白。只有ST3Gal4的过表达产生，但在此种情况下，唾液酸化作用键合不同于血浆来源的蛋白质。为了重组产生如同它们在人体内循环中被发现的与它们天然存在的对应物高度类似的治疗性蛋白，因此有必要改变它们的N-连接聚糖的触角和任选地还有末端唾液酸的键合类型。α1-抗胰蛋白酶(AAT)是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的蛋白酶抑制剂。AAT是丝氨酸蛋白酶，特别是中性粒细胞弹性蛋白酶的有效抑制剂。AAT是携带3个N-糖基化位点(即Asn46、83和247)的52kDa糖蛋白，所述3个N-糖基化位点主要携带二触角(Asn46、83和247)以及三触角N-聚糖(Asn83)。从人血清中纯化的AAT在二-和三-触角N-聚糖处含有α-2,6-连接的神经氨酸，并且一些三触角N-聚糖每个N-聚糖另外含有一个单一α-2,3-神经氨酸。通过HPLC测量的不同人血浆来源的AAT样品中的三触角N-聚糖的量平均为12％(+/-0,4％)，没有检测到四触角N-聚糖。人重组AAT在广泛的范围内的哺乳动物细胞中的表达已经显示产生rhAAT(重组人AAT)，其具有增加量的三触角N-聚糖和甚至四触角N-聚糖结构达到10％和更高的程度。这与人血清来源的对应物形成鲜明对比。对于哺乳动物细胞中表达的其他重组蛋白同样如此，例如C1抑制剂(C1Inh.)。蛋白酶抑制剂C1酯酶抑制剂(C1Inh)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。其主要功能是抑制补体系统以防止自发活化。500个氨基酸的蛋白质被高度糖基化，具有7个预测的N-聚糖和8个预测的O-连接的聚糖。与rhAAT一样，来自哺乳动物表达系统的rhC1Inh展现增加量的三-和四-触角N-聚糖结构，这在血清来源的对应物中未见到。为了实现此类蛋白质中所有N-聚糖分支的完全唾液酸化，ST3Gal4唾液酸转移酶的额外表达是必需的，因为由于对三-和四-触角N-聚糖的核心β1→4分支和核心β1→6分支的低亲和力，ST6Gal1唾液酸转移酶的表达不足够有效，从而产生与血浆蛋白的差别不仅在于它们的N-聚糖触角而且在于唾液酸化键合的重组蛋白。因此，本专利技术所要解决的技术问题是提供具有主要用二触角N-聚糖进行的同质翻译后修饰的重组糖蛋白，以及能够重组产生此类蛋白的细胞系。通过权利要求中表征的实施方案实现了对上述技术问题的解决方案。特别地，在第一方面，本专利技术涉及细胞系，其经遗传修饰以降低GnTIVa/b和GnTV中至少一种的表达。GnTIVa和GnTIVb是糖基转移酶，其参与N-乙酰葡萄糖胺(GlcN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞系，其经遗传修饰以降低GnTIVa/b和GnTV中的至少一种的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.15 EP 16000374.51.细胞系，其经遗传修饰以降低GnTIVa/b和GnTV中的至少一种的表达。2.根据权利要求1所述的细胞系，其中所有GnTIVa/b和GnTV的表达被降低。3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞系，其中GnTIVa/b和/或GnTV的表达被完全消除。4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系还被遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是昆虫细胞系、禽类细胞系或哺乳动物细胞系，优选人类细胞系。6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系来源于选自以下的细胞系：美洲家鸭细胞非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)、MadinDarby犬肾细胞(MDCK)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肝癌细胞系(HepG2、Huh7)、人胚胎肾293(HEK293)细胞、人神经元前体细胞(NC5T11)、人胚胎成视网膜细胞(Per.C6)、骨髓瘤细胞系(HMCL、MM.1、U266、RPMI8226)、CML肿瘤细胞系(NM、NM-F9)、杂合HEK293和淋巴瘤细胞(HKB11)，以及人羊水细胞来源的CAP细胞。7.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系来源于人原代羊水细胞，所述人原代羊水细胞包含编码腺病毒E1和pIX区域的基因产物的至少一种核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：西尔克·威辛，詹斯·沃尔菲尔，尼科尔·浮士德，赫尔穆特·基韦斯，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE