具有降低的触角岩藻糖基化的重组糖蛋白制造技术

本发明专利技术涉及通过过表达α‑2,6‑唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α‑2,3‑唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和糖蛋白来降低重组表达糖蛋白中复杂型N‑聚糖的触角岩藻糖基化的方法。还公开了能够用于所述方法的细胞系、各自的重组糖蛋白，以及在所述细胞系中表达所述重组糖蛋白的方法。

Recombinant glycoprotein with reduced fucosylation of antennae

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有降低的触角岩藻糖基化的重组糖蛋白本专利技术涉及降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化的方法、能够用于所述方法的细胞系、各自的重组糖蛋白以及在所述细胞系中表达所述重组糖蛋白的方法。目前大多数重组治疗蛋白为糖蛋白。糖蛋白具有与天冬酰胺的氨基连接的糖残基(N连接聚糖)，或与丝氨酸或苏氨酸的羟基连接的糖残基(O连接聚糖)。多糖的结构是高度可变的，这取决于用于重组表达的特定蛋白和宿主细胞。所谓的复杂型N-聚糖是在哺乳动物表达平台表达的糖蛋白上发现的非常常见的N-聚糖结构，其特征是核心糖序列Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsN-。这种核心结构由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)引发的“触角”延伸。通常，复杂型N-聚糖具有两个、三个或四个触角，但是在少数情况下能够有五个或六个触角。二个触角复杂型N-聚糖的通常结构如图1中的A所示。复杂型N-聚糖能够岩藻糖基化。在哺乳动物细胞中，岩藻糖通过α1-6键与近端GlcNAc连接(核心岩藻糖)，或者通过α1-3键在一个或多个触角上与末端GlcNAc连接(触角岩藻糖；也称为路易斯抗原(Lewisxantigen,Lex)、CD15或SSEA-1)，如图1中的B所示。如果路易斯结构(Gal(β-4)[Fuc(α)]GlcNAc-R)含有另外的唾液酸，所得结构称为唾液酸-Lewisx、唾液酸-Lex或SLex(NeuAc(α1->4)Gal(β-4)[Fuc(α1->3)]GlcNAc-R)，如图1中的C所示。唾液酸-Lewisx结构是由不同岩藻糖基转移酶催化的末端GlcNAc处的唾液酸化复杂型N-聚糖的岩藻糖基化形成的。核心α1-6岩藻糖基化在抗体中的作用已被广泛研究。IgG类抗体通常在Fc区的CH2结构域携带N-聚糖。存在于这些N-聚糖上的核心岩藻糖显著降低了体内抗体介导的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)反应。由于ADCC通常是治疗性抗体的非常期待的效果，因此采取了若干方法来减少核心岩藻糖在IgG上的存在。高免疫原性核心α1-3连接的岩藻糖结构只存在于植物和无脊椎动物中，而不存在于人细胞中。免疫球蛋白上通常没有触角岩藻糖，但是在其它血清糖蛋白上很容易检测到Lewisx或唾液酸-Lewisx结构。迄今为止，对其生理作用知之甚少。有证据表明触角岩藻糖可能通过选择素相互作用来增加对炎症部位的靶向性，但除此之外，对触角岩藻糖化的生理作用知之甚少。当重组表达血浆蛋白时，与血浆中天然存在的对应物相比，该产物通常显示升高水平的触角岩藻糖。为了降低替代疗法中使用的重组蛋白的潜在免疫原性效应，期望重组蛋白尽可能与内源性蛋白相似。重组治疗性蛋白上触角岩藻糖的减少是实现该目标的重要步骤。因此，本专利技术的技术问题是提供降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化(Lex或SLex)的方法，以及各自的重组糖蛋白及生产所述重组蛋白的方法。上述技术问题的技术方案通过权利要求中表征的实施方案来实现。具体而言，第一方面，本专利技术涉及降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖Lex或唾液酸-Lex的触角岩藻糖基化的方法，包括β-半乳糖苷β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)与糖蛋白一起过表达的步骤。如本文所用，术语“复杂型N-聚糖”系指特征为核心糖序列Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsN-的N-聚糖。这种复杂型N-聚糖核心糖序列能够由2到6根由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)引发的触角延伸，其中通常是两根、三根或四根触角。所述触角在本文中有时被称为“复杂型N-聚糖触角”。此外，如本文所用，术语“复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化”系指岩藻糖在至少一个复杂型N-聚糖触角上与末端GlcNAc的α1-3连接。在本文中，术语“末端GlcNAc”系指除了聚糖的初始GlcNAcs之外的存在于触角中的任何GlcNAc。术语“降低复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化”涉及这样的事实，即根据本专利技术，通过与糖蛋白一起过表达ST6Gal1和/或ST3Gal4，产生了重组糖蛋白，与常规重组糖蛋白相比，该重组糖蛋白具有较低量的岩藻糖基化复杂型N-聚糖触角。优选地，这种重组糖蛋白的特征在于，与不过表达ST6Gal1和/或ST3Gal4的情况下表达的相同重组糖蛋白相比，复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化显著降低。在特别优选的实施方案中，重组表达糖蛋白的至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％或更多的复杂型N-聚糖触角未被岩藻糖基化。适用于本专利技术方法的糖蛋白没有特别限制，只要它是具有复杂型N-聚糖和各自复杂型N-聚糖触角的糖蛋白。在优选的实施方案中，糖蛋白选自α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞生长因子(HGF)、因子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、vonWillebrand因子(vWF)、碱性磷酸酶和C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1Inh)。此外，糖蛋白优选为哺乳动物糖蛋白，更优选人类糖蛋白。如本文所用，术语“重组表达糖蛋白”涉及在基因修饰的生物体或细胞中通过生物技术生产的糖蛋白。对重组表达糖蛋白以及与这种糖蛋白一起过表达ST6Gal1和/或ST3Gal4的方法没有特别限制，并且是本领域熟知的。下文中与本专利技术细胞系相关的本专利技术第二方面在此方面提供了另外细节。在本专利技术的具体实施方案中，ST6Gal1和ST3Gal4与重组糖蛋白一起过表达。在本专利技术的其它具体实施方案中，(i)β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)未与重组糖蛋白一起过表达，以及/或者(ii)α-1,3-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶A(GnTIVa)、α-1,3-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶B(GnTIVb)和α-1,6-甘露糖糖蛋白6-β-N-乙酰葡糖胺转移酶A(GnTV)的表达未降低。在本文中，术语“ST3Gal1未与重组糖蛋白一起过表达”涉及这样的事实，即与天然ST3Gal1表达相比，ST3Gal1表达不以任何方式增加。在特定实施方案中，完全不表达ST3Gal1。此外，术语“GnTIVa、GnTIVb和GnTV的表达未降低”意指与所述蛋白的天然表达相比，所述蛋白的表达不以任何方式降低。第二方面，本专利技术涉及细胞系，优选昆虫、鸟类或哺乳动物细胞系，更优选哺乳动物细胞系，特别是人细胞系，其被基因修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal11)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)。如本文所用，术语“经基因修饰以过表达ST6Gal1和/或ST3Gal4的细胞系”表示一旦基因修饰，细胞系的单个细胞显示出比基因修饰前更高的各自的唾液酸转移酶的表达。使给定蛋白过表达的基因修饰没有特别限制，并且是本领域熟知的。在特定的实例中，细胞系包含编码ST6Gal1和/或ST3Gal4的内源基因，例如人细胞系。在该等情况下，可以通过将启动子、增强元件和/或稳定元件插入细胞基因组中适于引起所述核酸过表达的位置，对细胞进行基因修饰。这能够通过使用TALENS、锌指蛋白、CRISPR-CAS9或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.降低重组表达糖蛋白中复杂型N‑聚糖的触角岩藻糖基化的方法，包括β‑半乳糖苷α‑2,6‑唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α‑2,3‑唾液酸转移酶4(ST3Gal4)与糖蛋白一起过表达的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.29 EP 17000521.91.降低重组表达糖蛋白中复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化的方法，包括β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)与糖蛋白一起过表达的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其中所述糖蛋白的特征在于，与不过表达ST6Gal1和/或ST3Gal4的情况下表达的相同重组糖蛋白相比，复杂型N-聚糖的触角岩藻糖基化显著降低。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述重组表达糖蛋白的至少80％的所述复杂型N-聚糖触角未被岩藻糖基化。4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述糖蛋白选自α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞生长因子(HGF)、因子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、vonWillebrand因子(vWF)、碱性磷酸酶和C1酯酶抑制剂(C1抑制剂；C1INH)。5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述糖蛋白是哺乳动物糖蛋白，优选人类糖蛋白。6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中(i)β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)未与糖蛋白一起过表达，和/或(ii)α-1,3-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶A(GnTIVa)、α-1,3-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶B(GnTIVb)和α-1,6-甘露糖基糖蛋白6-β-N-乙酰葡糖胺转移酶A(GnTV)的表达未降低。7.基因修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)和/或α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)的细胞系。8.如权利要求7所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码ST6Gal1和/或ST3Gal4的内源基因，并且还具有至少一基因元件，所述基因元件选自启动子、增强元件和稳定元件，所述启动子、增强元件和稳定元件插入基因组中适于引起ST6G...

【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯马丁·施密特，马库斯·里伯特，古德伦·希德纳，西尔克·维辛，延斯·韦尔费尔，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE