O‑聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用于生产其的细胞系制造技术

本发明专利技术涉及经遗传修饰以过表达β‑半乳糖苷a‑2,3‑唾液酸转移酶1(ST3Gal1)、优选人类ST3Gal1的细胞系，其可以用于生产具有高度或完全唾液酸化的O‑连接的GalNAc聚糖(GalNAc O‑聚糖)、优选核1GalNAc O‑聚糖的重组糖蛋白，本发明专利技术还涉及相应的重组糖蛋白。另外，本发明专利技术涉及表达重组糖蛋白的相应方法、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度的方法以及降低GalNAc O‑聚糖的微异质性的方法。最后，本发明专利技术涉及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、用于增加重组糖蛋白的唾液酸化程度以及用于降低重组糖蛋白的O‑连接的GalNAc聚糖的微异质性的相应用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】O-聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用于生产其的细胞系
本专利技术涉及经遗传修饰(geneticallymodified)以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)、优选人类ST3Gal1的细胞系，所述细胞系可用于生产具有高度或完全唾液酸化的(sialylated)O-连接的GalNAc聚糖(GalNAcO-聚糖)、优选核1GalNAcO-聚糖的重组糖蛋白，本专利技术还涉及相应的重组糖蛋白。另外，本专利技术涉及表达重组糖蛋白的相应方法、增加重组糖蛋白唾液酸化程度的方法和降低GalNAcO-聚糖的微异质性的方法。最后，本专利技术涉及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、用于增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和用于降低重组糖蛋白的O-连接的GalNAc聚糖的微异质性的相应用途。
技术介绍
由于它们的临床重要性，治疗性蛋白质的发展在过去几年中被大大加快。然而，由于难以获得具有有利糖基化模式的蛋白质，治疗性蛋白质的发展通常被耽误，特别是对于复杂的糖基化蛋白质。这通常导致次优的药理学性质，如例如降低的血清半衰期或提高的免疫原性。另一个缺点是由于翻译后修饰(post-translationalmodification)中的变异导致的治疗性蛋白质的异质性，特别是糖结构的异质性。这可能导致不同生产批次之间的产品质量不一致。因此，为了促进治疗性蛋白质的发展，重要的是实现均匀的翻译后修饰。糖基化是最常见的翻译后修饰。几乎所有的生物药物都需要正确的糖基化以便显示出最佳的治疗效果。通常，糖基化是指糖与蛋白质表面的共价连接，其中糖连接到天冬酰胺残基产生N-连接的聚糖(N-聚糖)，或连接到丝氨酸或苏氨酸残基产生O-连接的聚糖(O-聚糖)。最常见的O-连接的聚糖组是GalNAcO-聚糖，其中丝氨酸或苏氨酸与N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)连接，N-乙酰基-半乳糖胺进而与另外的单糖连接。如本文所使用的，术语”O-连接的聚糖”或”O-聚糖”总是涉及GalNAcO-聚糖。如上所述，糖基化模式在分子之间可以非常多样化，因为连接的形式可以在单糖顺序、分支模式和长度(微异质性)方面不同。此外，并非所有糖基化位点都被完全占据(宏异质性)。糖基化影响蛋白质的溶解度、它们对蛋白水解的抗性以及它们与其它蛋白质或蛋白质受体如例如ASGPR(去唾液酸糖蛋白受体)的结合性能，并因此影响血浆中糖蛋白的半衰期。对于小于约50kDa的小尺寸蛋白质，清除主要通过肾清除进行。除了蛋白质的大小之外，蛋白质表面电荷也对肾清除有影响，因为肾脏中高度带电的蛋白质的过滤被降低。对于大尺寸蛋白质，通过特异性和/或非特异性肝摄取，清除主要发生在肝脏中。特异性摄取介体的实例是ASGPR，其特异性结合非唾液酸化的N-连接的糖蛋白与末端半乳糖。由于这种受体的作用，以末端唾液酸覆盖相邻的碳水化合物半乳糖的糖蛋白，与在N-连接的聚糖上具有末端半乳糖残基的非唾液酸化的对应物相比，半衰期提高了多达至100倍。其他受体特异性结合甘露糖、N-乙酰基-葡萄糖胺或岩藻糖并且从体系中清除具有这些末端糖的糖蛋白。从这个角度来看，包含高度末端唾液酸化的天然N-糖基化模式对治疗性蛋白质至关重要，因为它决定了治疗性蛋白质的药代动力学性质。此外，糖蛋白上具有适当键合的末端唾液酸降低了糖蛋白的免疫原性。获得接近天然糖结构和高度唾液酸化的最重要的策略是，在能够将哺乳动物样(mammalian-like)糖结构与蛋白质连接的细胞系中产生重组蛋白，例如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。然而，CHO细胞缺乏催化唾液酸的2,6-连接所需的酶，因此它们只能催化2,3-连接。此外，除了N-乙酰神经氨酸(唾液酸；NeuAc)之外，它们还将N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)连接至聚糖，其是一种在人类中不合成的糖，因此在注入到人体中时是免疫原性的。因此，更好的策略是由源自人细胞的细胞系如CAP细胞(源自人羊水细胞(amniocyte))或HEK293细胞(源自人胚肾细胞)产生治疗性蛋白质。然而，在发酵期间，从哺乳动物细胞系分泌的治疗性蛋白质的唾液酸化通常是不完全的。由于唾液酸化对于蛋白质的药代动力学特征的重要性，进行了大量的努力来增加唾液酸化程度。N-连接的糖基化的完全唾液酸化的有益效果是很好理解的，但是对于O-糖基化的效果知道的相对较少。因此，到目前为止，所有旨在改善唾液酸化的细胞工程工作都注重于N-连接的糖结构。O-连接的GalNAc聚糖总是具有连接到丝氨酸或苏氨酸的α-连接的N-乙酰基半乳糖胺残基。GalNAc可以用如半乳糖、GlcNAc、岩藻糖或唾液酸的残基进行扩展。对于O-连接的GalNAc糖基化，可以区分四个主要核结构，核1(GalGalNAc)、核2(GalGlcNAcGalNAc)、核3(GlcNAcGalNAc)和核4(GlcNAc2GalNAc)(图1)。通常例如利用磷酸盐、硫酸盐、羧酸或唾液酸进一步修饰末端。O-连接的GalNAc聚糖在保持完全折叠的蛋白质的结构、赋予蛋白酶稳定性中起作用。图2显示了核1和核2GalNAcO-聚糖的生物合成。尽管公认末端唾液酸对N-连接的聚糖关于治疗性蛋白质半衰期的增加有显著的积极影响，但是在O-连接的GalNAc聚糖处的末端唾液酸的可能效果和O-连接的结构的确切外观不太清楚。人类胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP6)具有五个O-连接的糖基化位点，并且与去糖基化形式相比，O-糖基化形式的血液清除率降低，表明了O-连接的聚糖的一般参与，但唾液酸的作用仍不清楚。B细胞激活因子受体3(BR3)-Fc具有多个O-连接的糖基化位点，并且唾液酸化水平在制造过程中会变化。分离不同的形式，可以显示，由于在肝中的摄取和降解，特别是通过非实质细胞介导的清除，BR3-Fc的去唾液酸化的O-连接的聚糖上的暴露的半乳糖与快速清除相关联。有趣的是，随着去唾液酸GalNAc的增加，也观察到与唾液酸化的Gal增加有关的清除率的降低，表明末端去唾液酸Gal可能是清除信号。脂联素(脂肪细胞分泌的胰岛素敏化激素)具有三个推定的O-连接的糖基化位点，这对于多聚体形成是不必要的，但与唾液酸化的蛋白质相比，去唾液酸化蛋白质的血浆清除被加速。迄今为止，还没有描述在糖蛋白重组表达过程中会影响O-连接的GalNAc聚糖的唾液酸化或结构的方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的技术问题是提供具有高度或完全唾液酸化的GalNAcO-聚糖的重组糖蛋白以及能够重组产生这种蛋白质的细胞系。此外，应提供表达重组糖蛋白、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和降低GalNAcO-连接的聚糖的微异质性的相应方法，以及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和降低GalNAcO-连接聚糖的微异质性的用途。上述技术问题的解决方案由权利要求中所述的实施方式来实现。特别地，在第一方面，本专利技术涉及动物细胞系，优选昆虫、禽类或哺乳动物细胞系，更优选哺乳动物、特别是人类的细胞系，所述细胞系经遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)。如在此也在下文其他转移酶的背景下所使用的术语“经遗传修饰以过表达ST3Gal1的细胞系”，表明在遗传修饰后，与它们在遗传修饰之前相比，细胞系的各个细胞显示出更高的蛋白质(例如唾液酸转移酶)活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经遗传修饰以过表达β‑半乳糖苷α‑2,3‑唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的细胞系。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.07 EP 15000016.41.一种经遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的细胞系。2.根据权利要求1所述的细胞系，所述细胞系被进一步遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和/或过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码ST3Gal1的内源基因和可选的编码ST3Gal4和/或ST6Gal1的内源基因，并且进一步具有选自由启动子、增强元件和稳定元件组成的组中的至少一种遗传元件，所述遗传元件在适合于引起ST3Gal1和可选的ST3Gal4和/或ST6Gal1的过表达的一个或多个位置被插入到基因组中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的外源核酸和任选的编码β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和/或β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)的外源核酸。5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是哺乳动物细胞系，优选人类细胞系。6.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系源自选自由Vero细胞、MDCK细胞、BHK细胞、CHO细胞、HEK293细胞、HepG2细胞、Huh7细胞、NC5T11细胞、Per.C6细胞、HMCLs细胞、MM.1细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：西尔克·维辛，延斯·韦尔费尔，妮科尔·福斯特，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE