能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用，具体步骤如下：1)从人脐带分离人脐带间充质干细胞；2)构建重组表达载体PCMV3‑IL2‑bFGF；3)将步骤1)所得间充质干细胞和步骤2)所得重组表达载体PCMV3‑IL2‑bFGF用电转染方式获得能高效表达bFGF的间充质干细胞。本发明专利技术制备的能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞，为有效临床治疗创伤性脊髓损伤患者提供新的选择。人脐带间充质干细胞取材创伤性小，在临床应用前景更大，且采用电转染的方式，更便捷简单、安全高效。人脐带间充质干细胞在体内具有向炎症或损伤部位迁移的特性，高效表达bFGF的间充质干细胞是很好的因子运输工具，能使损伤部位保持较高的因子浓度，克服单纯bFGF治疗用量大、代谢快的缺点。

Preparation and application of human umbilical cord mesenchymal stem cells capable of efficiently secreting bFGF

The invention provides a preparation method and application of human umbilical cord mesenchymal stem cells capable of secreting bFGF efficiently. The specific steps are as follows: 1) isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells from human umbilical cord; 2) construction of recombinant expression vector PCMV3_IL2_bFGF; 3) construction of recombinant expression vector PCMV3_IL2_bFGF; 3) step 1) obtained mesenchymal stem cells and step 2) obtained recombinant expression vector PCMV382 L2 bFGF was used to obtain mesenchymal stem cells expressing bFGF efficiently by electrotransfection. The prepared human umbilical cord mesenchymal stem cells can efficiently secrete bFGF, and provide a new choice for effective clinical treatment of traumatic spinal cord injury patients. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs) are less invasive and have greater clinical application prospects. Human umbilical cord mesenchymal stem cells have the characteristics of migration to inflammation or injury sites in vivo. Mesenchymal stem cells with high expression of bFGF are a good factor transporter, which can maintain a high concentration of factors in the injured sites and overcome the shortcomings of large dosage of bFGF treatment and fast metabolism.

【技术实现步骤摘要】
能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用
本专利技术属于细胞治疗
，具体涉及一种能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用，尤其是一种复合人白介素-2(Interleukin-2,IL-2)信号肽的分泌型高效表达人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白的临床级人脐带间充质干细胞的制备方法及其在神经损伤修复中的应用。
技术介绍
神经损伤分为中枢神经系统损伤和外周神经系统损伤，其中中枢神经系统损伤会造成脊髓损伤等运动功能方面的障碍，而外周神经系统损伤会带来感觉障碍还有慢性疼痛，同样会给机体带来困扰，严重影响生活质量。目前，神经损伤方面的疾病并没有很好的治疗手段，神经损伤的修复和再生一直是至今尚未解决的难题之一，因此，损伤神经的合理修复、再生轴突快速生长、相应靶器官有效再支配一直是神经外科领域的研究热点，而单纯的应用生物蛋白因子的局限性，已经不能够满足当今人们对损伤后的恢复情况的要求，所以新的治疗方法仍然需要更进一步的探索。中枢系统疾病分为脑损伤和脊髓损伤，其中最常见的例如创伤性脊髓损伤(SCI)可以导致运动、感觉和自主功能障碍，这些导致的伤害对个人而言本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)从人脐带分离人脐带间充质干细胞；2)构建重组表达载体PCMV3‑IL2‑bFGF；3)将步骤1)所得人脐带间充质干细胞和步骤2)所得重组表达载体PCMV3‑IL2‑bFGF用电转染方式获得能高效表达bFGF的人脐带间充质干细胞；所述步骤3)中电转染方式的条件如下：步骤1)所得间充质干细胞0.6×107个，步骤2)所得重组表达载体PCMV3‑IL2‑bFGF 13μg，脉冲电压250ppV，驱动电压20pdV，脉冲时间10ms，循环次数20。

【技术特征摘要】
1.一种能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)从人脐带分离人脐带间充质干细胞；2)构建重组表达载体PCMV3-IL2-bFGF；3)将步骤1)所得人脐带间充质干细胞和步骤2)所得重组表达载体PCMV3-IL2-bFGF用电转染方式获得能高效表达bFGF的人脐带间充质干细胞；所述步骤3)中电转染方式的条件如下：步骤1)所得间充质干细胞0.6×107个，步骤2)所得重组表达载体PCMV3-IL2-bFGF13μg，脉冲电压250ppV，驱动电压20pdV，脉冲时间10ms，循环次数20。2.根据权利要求1所述的能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的分离人脐带间充质干细胞的方法如下：取离体的人脐带间充质干细胞，将其清洗、剔除血管后剪碎，培养；去除组织块，继续培养，待细胞长至80％-90％融合时传代，传代至第2～3代处于对数期生长，生长至70～80％汇合时，待用。3.根据权利要求1所述的能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，重组表达载体PCMV3-IL2-bFGF的构建过程如下：a)以质粒PCMV3-bFGF为模板，PCR扩增得到IL2-bFGF质粒；b)质粒PCMV3-bFGF经限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切，电泳回收PCMV3片段；c)将IL2-bFGF质粒和PCMV3片段进行连接，连接产物经转化、筛选得到重组表达载体PCMV3-IL2-bFGF；所述步骤a)中PCR扩增的引物对如下：引物1：CGGGGTACCATGTACAGGATGCAACTCCT引物2：CTAGTCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATGGPCR体系：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，黄霏霏，王留娣，谢园园，刘硕，王文清，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32